cDNA文库组标准流程一(Total RNA的提取).pdfVIP

中国试剂网 3.20.1.9 cDNA 文库组标准流程一(Total RNA 的提取) 1.试剂配制 准备工作： 1、研钵、5ml/10ml/ 25ml 移液管、100ml/250ml 量筒、250ml/100ml 容量瓶、药 匙、 试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部，置于烤箱内,180℃，烤6 小时。 2 、50ml/1.5ml 离心管、枪头等塑料制品用 0.1‰DEPC 水浸泡过夜后，121℃ 20mins 高压灭菌。 3、电泳槽及电泳托、梳子用3%双氧水处理。 4 、常用试剂及其配方： ▲DEPC 水：在1000ml 去离子水中加入100ul DEPC, 静置过夜后高压灭菌。 ▲0.78M 柠檬酸纳：PH=4~5 三水合柠檬酸纳 22.94g 加DEPC 水定容至100ml，室温放置备用。 ▲10%肌氨酸钠： 肌氨酸钠 10g 加DEPC 水定容至100ml，室温放置备用。 ▲变性裂解液： 0.78M 柠檬酸钠 8.25ml 10%肌氨酸钠 12.375ml 异硫氰酸胍 118.05g 加DEPC 水定容至 250ml ，室温放置备用 临用前加β-巯基乙醇使其终浓度为1% （v/v ） ▲ 2M 醋酸钠 PH=4.5 NaAc·3H2O 13.6g 加DEPC 水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用 中国试剂网 3.20.1.9 ▲3M 醋酸钠 PH=5 NaAc·3H2O 20.4g 加DEPC 水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用 ▲ 4M LiCL: LiCL 24.164g 加DEPC 水定容至100ml,高压灭菌，室温放置备用 ▲0.5M EDTA PH=8.0 EDTA 18.61g 用NaOH 调PH 值至8.0，定容到100ml，高压灭菌，室温放置备用 ▲10X MOPS (3- （N- 吗啉代）丙磺酸): MOPS 41.86g NaAC·3H2O 4.10g 0.5MEDTA （PH 8.0 ） 20ml 用NaOH 调PH 值 6.5 , DEPC 水定容到1L，室温避光放置备用。 ▲ 1x MOPS: 10x MOPS 30ml 加DEPC 水270ml ，用时现配。 ▲4x RNA Loading buffer: 10x MOPS 400ul 甘油（高压过） 200UL 溴酚兰 10ul 甲醛(37%) 72ul 去离子甲酰氨 310ul EDTA(0.5M PH 8.0) 8ul ErBr(10mg/ml in DEPCH2O) 70ul 在4 ℃ 可保持3 个月 ▲ 10x PBS pH=7.4 中国试剂网 3.20.1.9 NaCl 80g KCl 2g Na2HPO4 14.4g KH2PO4 2.4g 定容至 1000ml ▲变性电泳胶： 称取0.5g 琼脂糖，加入47.5ml 1x MOPs ，加热至琼脂糖熔化后，冷却至50℃左 右，加入2.5ml 甲醛，轻轻混匀后倒入电泳托上。 ▲变性电泳缓冲液： 在250ml 容量瓶内加入5ml 甲醛，用1x MOPS 定容至250ml 2.动物组织total RNA 的提取 1． 根据表 1 选择适当的组织量和相应的变性裂解液量，将变性裂解液分装 到RNase-free 的50ml 无菌离心管中，冰浴5 分钟。 2 ． 将组织样品放入变性裂解液中，在高速下匀浆 15-30 秒/次，直到看不见 组织和细胞碎片。 3 ． 根据表1 加入适量2M 的乙酸钠（pH4.0 ），反复颠倒混匀4-5 次。 4 ． 根据表1 加入适量酚/氯仿,加盖