神经生物学实验指导书.docVIP

神经生物学实验指导书 实验一 脑内重要神经核团和神经生物学研究方法简介 Methods for neuroscience research and nuclei in brain 实验目的 理解神经核团的概念，理解重要的神经核团；掌握脑立体定位图谱的使用方法；了解神经生物学研究的常用方法。 实验器材、试剂及实验材料 手术刀、毛剪、注射器， 1%戊巴比妥钠(Pentobarbital Sodium)、依文氏蓝(Evans Blue)， 大鼠。 实验步骤 脑的大致结构和重要神经核团 脑膜至外由内分别有：硬脑膜、蛛网膜、软脑膜，其下是大脑皮层，边缘系统等结构。重要的核团（神经内分泌相关的丘脑下部核团PVN（室周核）、PeN（室旁核）、SON（视上核）、ME（正中隆起）、Hippocampus（海马）等。下表给出几个重要核团的大致范围，值得注意的是：核团在不同截面上的位置和形状是不同的，因此具体位置应查阅图谱。 神经核团 距离前囟（mm） 中心线两侧（mm） 距脑背侧（mm） PVN（室周核） -1.0~-4.2 0.0~0.8 5.0~5.5 PeN（室旁核） 0.0~-3.2 0.0~0.5 6.5~9.5 SON（视上核） 0.0~-1.8 1.0~2.3 8.5~8.8 ME（正中隆起） -2.4~-3.4 0.0~0.5 9.5~10.0 Hippocampus（海马） -1.8~-6.2 0.5~6.3 3.2~8.0 实验内容 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠（40mg/kg）； 在颅骨前囟后3-5mm处打孔； 用微量注射器吸入3μl依文氏蓝，注入大鼠背侧三脑室。 大鼠断头，除去颅骨，观察脑的结构。 George Paxinos and Charles Watson，The Rat Brain in Stereofaxic coordinates，Academic press，1986 江湾Ⅰ型脑定位仪的使用 脑立体定位仪的原理 脑立体定位仪分为两大类：直线式和赤道式。 直线式脑立体定位仪的设计原则 利用动物颅骨表面的某些解剖标志同脑表面及深部某一结构的相对恒定关系，从外部确定脑深部各结构的位置。 用立体空间直角坐标，以mm为单位，描述脑深部某结构所在的空间位置。 用一坚固的金属主框，加上杆、夹组成准确而对称的头夹。用一组有三维立体滑尺的电极移动架来导向，电极可准确地插入脑内某一指定结构。 使用方法 装上耳杆、上颌固定器、电极移动架，调整主框架至水平，测试两耳杆中心接触处是否在正中处。 装上架假电极，用假电极测定耳杆中心的高度,然后将电极移到门齿板上缘,调整门齿板比耳间线低5mm（该调整须根据图谱定，要与图谱中的方法保持一致）。 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠（40mg/kg），将其固定在定位仪上。 按图谱确定核团的位置，在颅骨相应位置打孔。 按图谱在相应核团埋管。 神经生物学研究的常用方法 神经科学的发展与的研究方法的进步密切相关。总体上，神经生物学的研究方法有六大类：形态学方法、生理学方法、电生理学方法、生物化学方法、分子生物学方法及脑成像技术。 形态学方法 神经生物学研究中常用的形态学方法有束路追踪、免疫组化和原位杂交，其他还有受体定位、神经系统功能活动形态定位等方法。 束路追踪法 追踪神经元之间的联系是神经解剖学研究中的重大目标，它对研究神经元的功能、神经系统的发育和成熟都具有重要意义。这种方法学的建立始于19世纪末的逆行和顺性溃变（顺行溃变指胞体或轴突损伤后的轴突终末的溃变，逆行溃变指去除靶区之后神经元胞体的溃变）研究。20世纪40年代主要手段是镀银染色法，根据变性纤维的形态变化来判断变性纤维。20世纪50年代发展了Nanta法，能遏制正常纤维的染色而仅镀染出变性纤维。但该法不易显示细纤维，1971年Kristenson等将辣根过氧化物酶（HRP）注入幼鼠的腓肠肌及舌肌结果在脊髓和延脑的相应部分运动神经元胞体内发现HRP的积累 。不久LaVail正式使用HRP作为轴突逆行追踪，以后遂广泛应用于中枢神经系统的研究。HRP可被神经末梢、胞体和树突吸收，轴突损伤部分也可摄入。在胞体内，HRP的活性可持续4~5天，在溶酶体内对联苯胺呈阳性反应而显现出来。被标记的神经元可以清晰的显示胞体、树突及轴突。 除了HRP标记法，还有荧光物质标记法、毒素标记法、注射染料等方法。 免疫组织化学 ，检测细胞内多肽、蛋白质及膜表面抗原和受体等大分术是应用抗原与抗体结合的免疫学原理子物质的存在与分布。这种方法特异性强，敏感度高，进展迅速，应用广泛，成为生物学和医学众多学科的重要研究手段。近年随着纯化抗原和制备单克隆抗体的广泛开展以及标记技术不断提高，免疫化学的进展更是日新月异，不仅用于许多基本理论的研