乌苏里蝮蛇蛇毒神经毒纯化及鉴定.doc

吉林省高等教育自学考试吉林大学生物制药专业 本科毕业设计 设计题目：乌苏里蝮蛇蛇毒神经毒纯化与鉴定 设计作者： 韩大伟 考 号： 010605100329 指导教师： 完成时间： 2009-8-10 吉林大学生命科学学院 二ＯＯ九 年 八 月 十 日 目 录 一 绪 论 1 1．蛇毒中的毒素及活性因子概述 1 1.1作用于血液本身或各种血液成分的物质 1 1.2影响血液循环物质 2 1.3作用于横纹肌的物质 2 1.4作用于平滑肌的物质 2 1.5影响代谢的物质 2 1.6改变血液中碱储备的物质 2 1.7胞溶素 2 1.8出血毒素 2 1.9抑制因子 3 1.10影响神经系统的物质 3 2．蛇毒神经毒素(neurotoxin，NT)的概述 3 2.1分布 3 2.2种类 3 2.3结构及理化性质[3] 4 2.4药理性质 4 3．蛇毒神经毒素的镇痛特点 5 3.1 起效慢，维持时间长，效价高 5 3.2 无耐受和成瘾性 6 4．蛇毒神经毒素的镇痛机制研究 6 4.1镇痛作用与毒性的关系 6 4.2镇痛作用与痛觉调控相关方面的关系 7 4.3与 NO 的关系。 9 5．蛇毒神经毒素的应用 9 5.1作为检侧尼克酰胺型AchR的标记物 10 5.2用于AchR的纯化 10 5.3作为研究药物与受体相互作用的工具 11 5.4作为研究AchR结构与性质的工具 11 6．蛇毒神经毒素的临床应用 11 7．本研究的目的 12 二 实验材料与方法 14 1．实验材料 14 1.1试剂 14 1.2仪器 15 1.3小鼠 15 2．实验步骤与方法 15 2.1纯化工艺条件摸索 15 2.2乌苏里蝮蛇蛇毒神经毒素筛选策略 20 2.3乌苏里蝮蛇蛇毒分离前的处理 20 2.4 乌苏里蝮蛇蛇毒离子交换色谱 20 2.5凝胶过滤色谱纯化神经毒素 22 2.6神经毒素的鉴定 23 三 实验结果与讨论 26 1．蝮蛇毒中神经毒素的分离 26 1.1乌苏里蝮蛇蛇毒离子交换色谱 26 1.2凝胶过滤色谱纯化神经毒素 27 2．神经毒素的鉴定 28 3．小结 29 四 结 论 30 1．结论 30 2．进一步工作的几点建议 30 参考文献 32 摘 要 i Abstract ii 致 谢 i 一 绪 论 蛇作为一种古老的动物在地球上已经生存了1.35亿年。在现今存活的2700种蛇中，有毒蛇600多种，其中剧毒的有195种。我国蛇类资源丰富，已发现的蛇有165种，其中毒蛇有47种，隶属于4科25属，主要分布在长江以南地区。 乌苏里蝮蛇 (Gloydius ussurensis)，俗名土球子、草上飞、七寸子。属蝰蛇科(Crotalidae)，蝮蛇亚科，蝮蛇属(Agkistrodon)。主要分布于黑龙江、吉林等省。该蛇头部略呈三角形，头背有一深色倒“V”字形斑纹。成体长 45～65cm，体重 300～400g。中段背鳞21 行，腹鳞加尾下鳞 188～213 行，背面浅褐色，中央的两行有色较浅的暗褐色圆斑，通达尾末。眼后白眉显著，下颌部黄白色，一般无斑纹，少数呈灰色网纹。成体尾端不呈黄白色。雄蛇的尾较长，尾基较粗 ，自此向后逐渐变细。雌蛇尾较短，自泄殖腔孔向后突然变细[1]。 1．蛇毒中的毒素及活性因子概述 蛇毒是毒蛇头部两侧皮肤下方毒腺的分泌物，咬啮物体时经毒牙流出。7～8 月排毒量最大，成体平均每次可排毒31. 98mg， 一般一个月采 1 次。蛇毒的主要生物学功能是帮助蛇捕食和消化食物。蛇毒中的毒素种类很多，都属于蛋白质和多肽。各种毒素或者单独作用或者协同作用。对蛇毒中的毒素分类方法很多， Kfobusitzty(1936)根据[2]毒素的生理作用把蛇毒中的毒性组分大致分为10类： 1.1作用于血液本身或各种血液成分的物质 所有这类物质，或是加速，或是延缓血液凝固，或是引起溶血，或是减弱白细胞的活动性。这类物质如类凝血酶，直接溶血因子等。 1.2影响血液循环物质 这类物质一部分作用于血管舒缩中心，一部分作用于血管末梢，使其舒张。此类物质如某些心脏毒素，舒缓激肽增强因子和降压因子等。 1.3作用于横纹肌的物质 这些物质可以改变肌肉细胞的通透性，引起组织肿胀，有些也可以引起心肌的收缩。 1.4作用于平滑肌的物质 通过对一些分离器官，如小肠，子宫，输卵管的实验，可以证明此类物质的存在。小剂量蛇毒或其组分可以引起上述器官的收缩，大剂量则可以使其麻痹。 1.5影响代谢的物质 给家兔按每千