家蚕卵半胱氨酸蛋白酶纯化及抗血清制备.pdfVIP

维普资讯 ；zDo {一 动 物 学 研 究 1993，14 (1)：9}一95 堡 =婴 z0DJ0giealResearch CN 53-1040 ／Q 家蚕卯半胱氨酸蛋 白酶纯化及抗血清制备 PURIn CATIoN OFA CYSTEINE PRoTEINASE FRoM EGGSoFSILKMoTH (Born mori) AND PREPARATIoN oFTHEANTISERUM 关键词 ：家蚕， 醚篓蜻 自 ，纯化，抗血 KeywordsiSilkmothl(Bombyxmori)， Antiserutn 据报道．家蚕卵中存在半眭氨酸蛋白酶 (Cysteineproteinase，CP)，其性质 与哺乳类溶酶体半胱氨酸蛋白酶类 的 组织蛋 白酶 L相似 ．最佳作用 pH 为 35．体外最适作用底物为牛血红蛋 白，体 内最适作用底物为卵黄磷聋白．经 SDS分析，分子量为47KD。其主要作用是在胚胎发育过程中释解卵黄蛋白质，供胚胎发育之需要． 在成熟卵中异很高古量 的半虢氨酸蛋 白酶，在胚胎发 育开始前．并不发生卵黄蛋 白质的水解，其作用机制 尚待阐 明。为了进一步研究半虢氨酸蛋白酶的组织分布 告成位点、及 eDNA克隆等，作者从家蚕卵中纯化了半肮氨酸蛋 白酶 ，并制备了抗血清。 材辩和方涪 家蚕 由实验室饲养 ．牛血红蛋 白购于 日本 Worthington公司．DEAE—CellulosefDE一52)购于 日 本 Whatman公司．SepharoseCL-6B购于Pharmacia盐司．羟基磷灰石由高桥进教授告成，其余试剂为分析纯． 剖腹取充分成熟的家蚕卵，加入缓冲液 (10mmol／LT— Hcl，pH70，lmmol／LEDTA，2 mol／L琉基 乙醇)匀浆，离 心 1h f1800~／min)，取上清 液加入饱和硫酸铵至 45％，搅拌 15min后 离心 fl0000r／rain 30min)，雎沉淀物溶于少量缓冲液 中，经透析后加剜 DEAE-纤维素柱上层析 (2．5×50 (cm))，以古 0．5mol／L NaCI的缓冲灌洗脱。收集活性部分，透析，过羟基磷灰石柱 (1xl(era))。过滤藏经超滤澈靖 (滤膜Up一20)加到 DEAE-Toyopearl柱 (1x30fcm))，以 0．5mol／LNaCI缓冲藏梯度洗脱．收集半赦靖活性部分，经 Sepharose CL-6B柱 (4x1o0 (cm) )层析．再经 DEAE-Toyopead柱 (1×30 (cm))进一步纯化。纯化产物经浓缩后加入 20％甘油贮存于-70℃。 以SDS分析产物纯度，方法参照 Laemmli(1970)。 酶活性分析参服 Kageyamaf1981)方法进行 ．反应液为 lmlpH35牛血红蛋白 f2％)，样品 10—2o0 ． 37℃ ，1h，以 2ml5％TCA 中止反应，取滤过液测 280nm 嗳光度 ．活性抑制实验在上述反应液 中增加 了N一 (N— f1，3-trans~arboxyran-2-carbony1)一L—lellcm)-agmatine，E_64。 蛋 白质古量铡定采用 Lowry法 ． 兔抗血清村备参照]hileyfl984)方法。 免疫沉淀电罚：参照SDS_PAGE方法略加修改． 结果 1．半脆氨酸蛋白酶纯化 从 10og卵中经6步纯化过程，最终获得 1．4mg纯化的半胱氨酸蛋白酶 (表 1)． 层析结果见 圈 1． 对每一步纯化产物进行了 SD