TGGE电泳系统的基础知识与操作.pdf

TGGE系统操作手册 TGGE Standard (024-000) 版本：6.0 2002年1月 1 新版本说明（略） 2. 安全指引 添加缓冲液请勿超过最大刻度； 如果仪器被缓冲液溅湿，请立即清洁； 必须盖上盖后才能运行; 加热模块是由Teflon材料保护的，请勿破坏该保护膜; 请勿用强力的洗洁液或化学品清洁加热模块; 在加热模块上请勿使用煤油及石蜡油; 如果在保护盖上出现严重的冷凝，请停止运行，用干布擦干后再运行; 请先关闭电源再移开安全盖; 请勿在运行过程中移动仪器； 在移动仪器时，请勿从上方提起，应该从下方托起； 3 简介 温度梯度凝胶电泳 （Temperature Gradient Gel Electrophoresis ）是新式的电泳技术，用于分离 DNA、RNA或蛋白质，该技术已申请专利。 商业性TGGE设备最早出现于1989年，由于具有前所未有的高分辨能力和操作简单等优点， TGGE在科研和临床应用中受到很大欢迎。应用领域广泛，包括使用分子生物学技术进行研究 的肿瘤学、病毒学、免疫学、RNA研究,也可用于蛋白质的构象分析和工业中的定量分析。 3.1 TGGE分析原理 传统的电泳分离方法基于分子的大小和带电荷数多少，TGGE则增加了一个新的分离参数，即 分子构象。分子的构象取决于分子的二级结构和三级结构，并受温度、盐浓度、pH值等外部因 素影响。稳定的构象由氢键和范德华力所维系，温度升高到某一限定点则可以破坏氢键和范德 华力，分子呈分叉状，迁移率明显下降，这时的温度称为变性温度（Tm ）。对于相同分子量的 DNA分子来说，其变性温度（Tm ）因分子序列的不同而不同。TGGE利用Tm值的不同来确定分 子序列是否存在差异。TGGE 电泳不仅可分离DNA/RNA ，也可提供DNA/RNA序列或者蛋白质 稳定性的资料。 3.2 TGGE系统特色 ⑴ 高分辨率：温度梯度板由微处理器控制，线性极为严格。2mm 的电泳距离最大可对应0.6 ℃ 的温度差，即使极细微的分子间差异也可以检测出来。 ⑵ 加样量小：2ngDNA或RNA片段可以清晰地相互区分开。 ⑶ 重现性好：易控制的电泳条件可保证电泳的重现性和结果的重复性。 ⑷ 节约时间：小面积温梯板和小尺寸凝胶大大节约电泳时间。 ⑸ 两种模式：垂直TGGE 电泳方向与温梯方向垂直，用于优化某个样本的分离条件，也可用于 检测PCR产物的组成。平行TGGE 电泳方向与温梯方向平行，可采用垂直TGGE所优化的电泳条 件，用于分析多个样品 垂直TGGE 温梯方向与电泳方向垂直; 只对一个样品进行分离； 在一个宽的温梯范围内进行分离以分析构象与 温度的关系，确定最佳变性温度； 平行TGGE 温梯方向与电泳方向平行； 同时对多个样品进行分离； 左图为垂直TGGE结果示意图，右图为平行TGGE结果示意图。 3.3 TGGE实验流程 TGGE是分离具有相同分子量但不同序列的分子的强力手段。然而，每一条DNA都有其独特的 性质，因此，请跟随以下的流程以确保实验的成功。下面是流程图，每一步的具体细节将在第8 部分进行叙述。 步 骤 1 ： 用 Poland 程 序 对 序 列 进 行 分 析 。 该 程 序 由 http://www.biophys.umi-duesseldorf.de/POLAND/poland.html提供，用于计算双链DNA 的熔解特性，帮助我们了解序列是否适用于TGGE 分析。本程序是完全免费的。 如果熔解