安徽师范大学分子实验考试试题.docVIP

1、PCR原理是什么？PCR技术是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。它的特异性是由两个人工合成的引物序列决定。引物就是与待扩增DNA片段两侧互补的寡核苷酸。双链DNA是在临近沸点的温度下加热时便会分离成两条单链DNA分子（变性），两引物分别与两条DNA的两侧序列特异复性，在适宜条件下，DNA聚合酶以单链DNA为模板，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸，在引物的引导下，按5→3方向复制互补DNA，即引物的延伸。在适宜的条件下，这种热变性→复性→延伸的过程不断循环重复，前一个循环的产物DNA可作为后一个循环的模板DNA参与DNA合成，使产物DNA的量按2^n方式扩增。 2、PCR一般体系应加入哪些试剂？10*PCR缓冲液（含Mg+）、模板DNA、四种dNTP、一对引物、耐热Taq聚合酶 3、PCR防止其它DNA污染应注意哪些问题？;无菌工作台操作，避免气体中有杂菌。 4、影响PCR产物产量的因素主要有哪些？dNTP的质量（优劣）与浓度、模板核酸的量与纯化程度、Mg2+浓度、温度与时间、循环次数 5、引物设计应注意哪些问题？1、引物长度不宜过长20bp左右较佳；2、引物扩增片段的长度以200-500为宜；3、引物碱基的中G+C的含量应在40-60%为宜，G+C太少则扩增效果不佳，G+C过多则易出现非特异条带；4、避免引物内部出现二级结构，避免两天引物间互补，特别是3端的互补否则会形成二聚体结构；5、引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。?? 6、简述克隆某一原核生物基因片段一般操作步骤？PCR技术对基因进行大量扩增，首先准备好实验材料大体为：需扩增的模板DNA、DNA聚合酶、dNTP混合液、PCR缓冲液、引物等、其过程大体分为3个步骤：第一步：变形：通过加热使DNA模板双螺旋链解离为单链，第二步：退火：当温度突然降低时。由于模板DNA结构复杂难再互补，而引物建构简单且数量巨多易于模板DNA互补杂交从而使引物结合到模板上DNA上，第三部：延生：在DNA聚合酶和四种底物及镁离子存在条件下DNA连开始延伸。以上3个步骤为一个循环，数小时后即可得到大量扩增的目的片段。?? 7、什么是质粒？质粒的基本性质有哪些？ 1、质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。2、具有复制起点。携带易于筛选的选择标记。具有多种限制性内切酶的切割位点。具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。8、质粒抽提实验中溶液I、II、III各有什么作用？ 溶液I:由葡萄糖,EDTA,Tris Cl组成.葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的机械剪切作用,防止破坏质粒DNA;EDTA的作用是络和掉Mg2+等二价金属离子,防止DNA酶对质粒分子的降解作用;Tris Cl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围。?溶液II:由SDS与NaOH组成.SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性;NaOH(pH12)的作用是破坏氢键,使DNA分子变性。溶液III:由KAc与HAc组成,是pH值为5.5的高盐溶液.能中和溶液II的碱性,使染色体DNA复性而发生缠绕并使质粒DNA复性.K+离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去.溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质,很容易与小分子的质粒DNA分离,此外,高盐溶液也有利于各种沉淀的形成。 9、碱裂解法抽提质粒DNA的基本原理是什么？ 碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA之间在拓扑学上的差异而达到分离目的。PH介于12.0~12.5时，线性DNA变性，双链打开，而质粒DNA虽变性，但两条互补链彼此缠绕，当PH恢复到中性时，质粒DNA可迅速准确的完成复性，而线性DNA复性较困难，缠绕成网状，通过离心可沉淀除去。10、在碱裂解法提取质粒DNA操作中应注意哪些问题？ 1、正确使用移液器。2、溶液ll必须新鲜配制。3、加入酚-氯仿后必须充分混匀。4、混匀的过程不能太过剧烈。5、每次弃上清液时都应用移液器吸去管壁上黏附的水珠。6、吸取酚-氯仿溶液时要将Tip头插入液体分层的下侧。（第一次试验的注意事项） 11、在碱裂解法提取质粒DNA时， 酚/氯仿的作用是什么？ 酚是强烈的蛋白质变性剂，能有效使蛋白质变性而除去，氯仿有强烈的脂溶性，去除脂类杂质，本身酚：氯仿：异戊醇=25：24：1的主要作用是抽提蛋白质 12、碱裂解法提取的质粒DNA分子一般有几种构象？电泳时移动速率有何差异？ 超螺旋DNA＞线性DNA＞开环DNA 13、提取植物基因组