疏肝健脾法对IBS--D模型大鼠脑肠轴异常通路调控机制研究.pdf

摘 要 本研究在课题组前期成功制备的IBS—D大鼠模型、肠激安方制剂工艺、肠激安方 治疗IBS．D药效学的基础上(广州市科技局课题：肠激安胶囊治疗腹泻型IBS产业化 一肠轴”异常的作用机制。 目的： 改进IBS—D大鼠模型，完善该模型的评价方法；探讨以疏肝健脾为治则组成的 方给药组和模型组下丘脑和结肠组织蛋白质双向电泳图谱，结合质谱技术鉴定并分 析差异表达蛋白，对候选表达差异蛋白进行蛋白质功能研究，进一步阐明疏肝健脾 法对IBS—D模型大鼠脑肠轴异常通路调控机制。 方法： (1)IBS-D模型的制备和评价：采用母子分离，束缚，醋酸刺激三因素法制备IBS—D 大鼠模型。模型组乳鼠从第2天至第14天每天上午8点到11点将乳鼠和母鼠分离3h， 然后与母鼠一起饲养至第22天断奶，第30天分笼。将所有模型大鼠混合均匀，从中 随机选取雌性大鼠30只。正常组不分离，于第30天同法操作。于出生后第35天剔 除体重小于|209者，随机选择雌性大鼠各20只，模型组每天上午给予番泻叶水煎液 按1ml／1009大鼠灌胃，灌胃结束后立即用纸袋束缚大鼠的前肩、前上肢和胸部，限 制其上肢挠抓头面部，但不限制其活动，束缚时间1h。正常组同法给予生理盐水灌胃， 不做束缚处理。连续灌胃l周，每天1次。通过大便含水量的测定、内脏高敏感性进 行评价，常规病理组织学检查等方法进行模型的评估。 中药饮片按常规方法制备成水煎液，大鼠药效学剂量为16．749／kg。将各组大鼠给予 相应的药物，给药体积为10ml／kg。正常对照组、模型对照组同法给蒸馏水10ml／kg。 每天灌胃1次，连续灌2周。末次给药三小时后，大鼠乙醚麻醉后眼球取血lml置于 1000 PBS洗液混匀，离心5min，弃去上清 rpm离心15min，弃去上清液，加入lml 液，将样品混悬于0．5mlPBS沈液中，结束后，立即取抗凝血加入荧光素标记的单克 隆抗体CD3+、CD4+、CD8+上流式细胞仪进行检测。 (31差异蛋白的筛选：采用双向凝胶电泳法分离IBS．D模型组和肠激安方中剂量组 TOF／TOF串联飞行时问质谱仪进行鉴定， 下丘脑和结肠组织差异蛋白，运用MALDI 运用Gene Ontology将所鉴定的差异蛋白进行功能分类，分析疏肝健脾法治疗IBS．D 病理机制中的蛋白相互作用。 (4)使用Western 结肠组织LGALS9蛋白的表达。 结果： (1)给予番泻叶灌胃和束缚前(第35天之前)，正常组和模型组大鼠粪便含水量均 较接近，无显著性差异(PO．05)；模型组大鼠灌胃番泻叶并进行束缚后粪便含水量 天)，模型组大鼠粪便含水量之问无显著性差异(P0．05)。 (2)给予番泻叶灌胃和束缚应激前(第35天之前)，模型组大鼠痛阈值与正常组大 鼠相比，无显著性差异(胗0．05)；给予番泻叶灌胃和束缚应激后，模型组大鼠与正 常组大鼠痛阈值存在显著性统计学差异(P：0．05)，模型组大鼠痛阈值降低，提示其 存在内脏高敏感性，对外界刺激反应较大；从第56天开始，模型组痛阈值升高，第 63天模型组大鼠痛阈值与第42天模型组大鼠痛阈值前后比较有显著性差异(p，0．05) (3)结肠病理检查：正常对照组大鼠结肠切片光镜下结肠粘膜形态完好，上皮细胞 排列整齐，纵形肌和环状肌分界清楚，粘膜下无充血、水肿，无炎性细胞浸润。模型 对照组大鼠结肠切片光镜下偶见上皮细胞排列不整，粘膜下轻度水肿，局部少量炎性 细胞浸润，杯状细胞显著增多，形态结构未见明显器质性改变。 (4)与模型组血清中CD3+相比，匹维溴铵组、肠激安方给药组血清中CD3+无统计 学差异，与正常组血清中CD4+相比，模型组CD4+比例明显降低，CDs+比例明显升高， CD8+明显降低。 (5)本研究运用蛋白组学的方法寻找IBS．D模型组和肠激安方中剂量组下匠脑和结 肠组织的差异表达蛋白谱，结果发现，在结肠组织中，经过生物质谱鉴定，共得到9 PRDXl、NDUFBlO、HBB．Bl。 (6)在下丘脑组织中，与模型组相比，肠激安方中剂量组大鼠下丘脑组织PRDXl 蛋白表达水平显著下降(P0．01)。在结肠组织中，与模型组相比，肠激安方中剂量 组大鼠结肠组织LGALS9蛋白表达水平明显下降(P0．05)。 lI