犬传染性肝炎核酸疫苗对Beagle犬的细胞免疫效果及免疫机制及研究.pdfVIP

中文摘要 犬传染性肝炎核酸疫苗对Beagle犬的细胞免 疫效果及免疫机制研究 摘 要 目的： canine 犬传染性肝炎(Infectious 染性肝炎病毒(ICHV)又称I型犬腺病毒引起的一种常见的 急性败血性传染病。本病广泛分布于世界各地，犬不分品种、 年龄和性别，可以全年发生，但以离乳至一岁以内的幼犬的 感染率和死亡率最高，对养犬业和实验犬的饲养均可造成极 大的危害。 目前主要通过接种灭活疫苗和减毒活疫苗预防ICH的 发生。在疫苗制备过程中病毒的逃逸以及灭活不完全均可造 成该病的暴发。紧急预防或治疗已发病的病犬可使用同型或 异型免疫血清或丙种球蛋白，但对犬的保护效果有限。 核酸疫苗是90年代从基因治疗研究领域发展起来的一 项新的生物技术，是将作为免疫原的一种或多种蛋白编码基 因克隆到真核表达载体(质粒)上，将构建的重组质粒直接 注入到体内而激活机体免疫系统，因此也有人称其为基因疫 苗。它的研究具有深远意义，可用于对细菌、病毒、寄生虫 等多种疾病的防治，其多价、高效、廉价等优点使其潜在的 应用价值不可估量。核酸疫苗可能对人类疾病的防治以及畜 牧业的健康发展起到划时代的作用。 本研究室的前期研究工作，用己构建的犬传染性肝炎核 中文摘要 异性体液免疫和细胞免疫，产生具有杀伤表达病毒抗原靶细 胞的CTL效应，显示出良好的免疫原性和免疫反应性。 为进一步验i正pVAX1一CpG．Loop对本动物犬的免疫效 果，寻求最佳的免疫剂量和免疫策略，本研究采用已构建的 犬传染性肝炎核酸疫苗免疫Beagle犬，进行攻毒试验，对其 免疫效果及免疫机制进行研究。 方法： l用碱裂解法大量提取真核重组质粒 将重组质粒阳性克隆菌接种于2xYT液体培养基振荡培 养36h；离心收集菌体。采用SDS一碱裂解法大量提取重组质 测定。 2重组Loop蛋白的提取 和层析柱纯化重组蛋白，透析并复性后浓缩目的蛋白。 3重组质粒pVAX1．CpG．Loop免疫Beagle犬 IRl次，最后一次与相同剂量的重组 400pg，600pg，800pg Loop蛋白共免疫；4号，5号，6号犬：分别经双侧股四头肌 注射重组质粒pVAXl一CpG—Loop 次，7号犬：已接种六联苗。 以上1．6号犬于免疫前15min均经股四头肌注射25％灭菌 蔗糖每倾lJ500btl。分别于0、8、16周免疫，末次免疫后6周， 进行攻毒实验。 (1号犬称为pp400，第一个P代表重组质粒 中文摘要 为control。) 4免疫效果评价 4．1T淋巴细胞增殖实验采用MTT法检测免疫犬的外 周血T淋巴细胞增殖活性。 Tox 96非放射 4．2蛋白特异性CTL活性分析采用Cyto 性细胞毒性检测试剂盒进行检测。 X 4．3淋巴细胞诱生因子的检测取5106／ml的犬外周 血淋巴细胞培养上清，采用犬IFN．Y与犬IL．4定量试剂盒 测定标本中IFN-Y与IL一4的浓度。 4．4IFN-Y酶联免疫斑点检测采用犬IFN．Y ELISpot 试剂盒检测分泌IFN-Y的效应T淋巴细胞数。 4．5RT-PCR检测细胞因子mRNA的表达采用 RT．PCR检测细胞因子IFN-Y和细胞因子IL．4的表达。 结果： 间。诱导表达的重组Loop蛋白经镍离子亲和层析纯化，在 GuNTA．200咪唑洗脱液中含量最高。 2在末次免疫后两周，重组质粒免疫犬外周血淋巴细 胞在体外分别