紫外吸收法测定核酸含量.pptVIP

实验十二 紫外吸收法测定核酸含量 实 验 目 的 （1）掌握紫外吸收法测定核酸含量的原理。 （2）掌握利用紫外分光光度计测定核酸含量的方法 原 理 DNA和RNA都有吸收紫外线的性质，最大吸收峰在260nm波长处。紫外吸收使嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的性质，所有含嘌呤和嘧啶的物质，都具有吸收紫外线的特性。核酸和核苷酸的摩尔吸收系数用ε（P）表示。ε（P）为每升溶液中含有1mol核酸磷时的光密度（即吸光度或光吸收）。RNA的ε（P）为7700～7800，RNA中磷的质量分数约为9.5%，因此每毫升溶液中含1.0μg RNA的光密度为0.022～0.024。小牛胸腺DNA钠盐的ε（P）（260nm，pH7）为6600，含磷的质量分数为9.2%，因此每毫升溶液中含1.0μg DNA钠盐的光密度为0.020。 不同形式DNA紫外光密度不同，因为DNA具有双螺旋结构，当过量的酸、碱或加热使DNA变性时，则出现ε（P）260nm值升高的增色效应。在核苷酸量相同的情况下，ε（P）260nm有以下关系：单核苷酸单链DNA双链DNA。DNA变性后，双螺旋结构被破坏，碱基充分暴露，导致紫外光密度增加，还可根据DNA溶液在260nm处光密度的变化监测DNA变性情况。变性DNA复性后，ε（P）260nm值降低，称为减色效应。 蛋白质由于含有芳香氨基酸，也能吸收紫外光。蛋白质的吸收峰在280nm,260nm处的光密度仅为核酸的1/10或更低，因此核酸样品只能够蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。RNA在260nm与280nm处的光密度的比值在2.0以上，DNA在260nm与280nm处的光密度的比值为1.9左右。当样品中蛋白质含量较高时该比值会下降。紫外吸收法测定核酸含量简便快速，灵敏度高，一般可达3μg/ml的检测水平。 操 作 方 法 一、将样品配制成每毫升含550g的核酸溶液，与紫外分光光度计上测定260nm处的光密度值，按下式计算核酸浓度和两者的吸收比值。 式中 OD260nm—260nm波长处的光密度值； L—比色杯的厚度，一般为1cm或0.5cm； 0.024—每毫升溶液内含1.0μg RNA的光密度值； 0.020—每毫升溶液内含1.0μg DNA钠盐的光密度值。 二、如果待测的核酸样品中含有酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，则在测定时需加钼酸铵—过氯酸沉淀剂，沉淀除去大分子核酸，测定上清液在260nm处的光密度作为对照。具体操作如下。 取两支小离心管，A管加入0.5ml样品和0.5ml蒸馏水，B管加入0.5ml样品和0.5ml钼酸铵—过氯酸沉淀剂，摇匀，在冰浴中放置30min，3000r/min离心10min，从A、B两管中分别吸取0.4ml上清液到两个50ml容量瓶内，定容至刻度。在紫外分光光度计上测定260nm处的光密度。 式中 ΔOD260nm--A管稀释液与B管稀释液在260nm波长处的光密度之差。 通常：1 OD=50ug/ml dsDNA 1 OD=40ug/ml ssRNA 1 OD=37ug/ml ssDNA * * *