目基因制备-基因文库法.pptVIP

基因组文库的质量评价和完备性 1.理论值 2.经验值 表 几种典型生物基因组文库大小与载体容量的关系 选择载体的主要参数是基因组大小 反转录合成单链cDNA 置换合成法合成cDNA第二链 引物-衔接头法合成cDNA第二链 cDNA文库的质量评价 1.文库的代表性 经验值计算 2.序列的完整性 cDNA文库的改良 1.均一化cDNA文库 基因组DNA饱和杂交法 2.二级复性动力学处理 全长cDNA文库 目的cDNA克隆的筛选和鉴定 cDNA文库与基因组文库的比较 cDNA文库的均一化，是指某一特定组织或细胞的所有表达基因均包含其中，且在cDNA文库中表达基因对应的cDNA的拷贝数相等或接近。均一化cDNA文库是克服基因转录水平上巨大差异给文库筛选和分析带来障碍的有效措施，有利于研究基因的表达和序列分析。 mRNA水平上，基因之间丰度差异极大； 基因组水平上，基因之间拷贝数差异不大，即基因在基因组上具有拷贝数相对一致的性质。 通过cDNA与基因组DNA饱和杂交降低高丰度mRNA在文库中高拷贝存在的cDNA的丰度。将随机打断的基因组总DNA片段标记为探针，与总cDNA单链饱和杂交，弃除未杂交的总cDNA，从cDNA-DNA杂交体上变性释放已均一化后的总cDNA，转化宿主。 二级复性动力学是指高丰度的cDNA在退火条件下复性速度快，而低丰度的cDNA复性要很长时间，可以通过控制复性时间来降低丰度。用羟基磷灰石柱将单链和双链cDNA分开，保留单链cDNA后转化宿主。 mRNA发生降解，第二链合成中DNA聚合酶的外切核酶活性、反转录酶特性的RNase H活性变化，反转录酶与mRNA模板的脱离(主要受mRNA复杂结构影响)等都可能会导致cDNA不完整。保持mRNA的完整性是构建全长cDNA文库的核心。mRNA完整性的确定可通过直接检测mRNA分子的大小，或测定mRNA的转译能力。 从cDNA文库中筛选和鉴定目的cDNA的方法主要有核酸分子杂交和免疫学检测分析等方法。 差别杂交（differential hybridization）又叫差别筛选（differential screening），适用于分离在特定组织细胞或发育阶段表达的、受生长因子调节的或药物诱导表达的基因。 （1）基因组文库克隆的是所有基因，包括未知功能的DNA序列和调控基因等，cDNA文库克隆的是所有表达的基因，即具有蛋白质产物的结构基因，包括调节基因。 （2）基因组文库克隆的是全部遗传信息，不受时空影响；cDNA文库克隆的是不完全的编码DNA序列，受发育和调控因子的影响。 （3）基因组文库中编码的基因是真实的基因，是带有内含子和外显子的基因组基因；从cDNA文库中获得的是经过剪切去除内含子的基因。 可获得的基因 对比研究异常基因 生物进化与同源性分析 基因表达 基因的结构功能调节研究 所有正在表达的基因 应用范围 ◆ ◆ ◆ ◆ 扣除文库 （subtracted library） 反应不同组织细胞或同一组织细胞不同功能状态下，基因表达差异的cDNA文库。 * 目的基因 需要克隆的DNA片段。 编码某种蛋白质 研究某基因结构和功能的关系 研究某基因与疾病的关系 目的基因的获取/制备 人工合成 cDNA文库 基因组文库 聚合酶链式反应 1. 基因文库 2. cDNA文库 3.人工合成 4. PCR 基因组文库(genomic library) 分离基因组DNA DNA片段与载体连接 导入细胞 筛选 限制性内切酶 基因组DNA 基因重组 转化细菌 体外包装 以 l 噬菌体制作基因 组文库 , 在一个基因组文库面 ， 所有可能的 基因皆被大量复制 。 利用探针筛选特定基因 。 组织或细胞染色体DNA 基因片断 克隆载体 重组DNA分子 含重组分子的转化菌 限制性内切酶 受体菌 基因组文库 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA片段的集合. 从基因组文库获取目的基因 每个细胞含有一个基因组DNA片段与载体的重组DNA分子，许多细胞组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合体. genomic library 基因库是通过重组技术转化筛选而建立，利用低等生物如细菌、病毒、噬菌体等生长快、繁殖能力强的特点作为一种核酸扩增的载体，把人类等高等生物的基因或其片段重组其中，成为便于保存、取用方便的基因库。建立基因库的目的是为了便于目的基因的保存、扩增和纯化。 基因组文库必须包括一定数量的重组子才可能克隆基因组中的任何序列。基因组文库完备性是指从基因组文库中筛选出含有某一目的基因的