新抑癌microRNA+miR-520e发现及其在肝癌中作用分子机制研究.pdf

摘要 摘要 肝细胞肝癌(hepatocellular Bvirus，HBV)慢性感染与肝癌的发生发展具有十分密切的 肝炎病毒(hepatitis BvirusX 关系，乙肝病毒表达的X蛋白(hepatitisprotein，HBx)具有重要的致癌 链小分子RNA，广泛存在于真核生物中，可作为癌基因或抑癌基因参与肿瘤的 病理过程，是当前国际研究的热点。本论文首次发现并报道了在肝癌细胞中 了深入系统的研究，主要研究结果如下： 第一部分：miR-520e对肝癌细胞生长的作用 肝癌组织中的表达情况。实时定量PCR结果显示，与正常肝细胞(L．02和Chug 表达。同时，miR．520e在23例临床肝癌组织中的表达水平显著低于其癌旁肝组 下调的分子机制进行了研究。生物信息学分析结果显示，在miR．520eDNA的上 游调控区存在一个CpG岛。应用甲基化特异-皑!PCR和亚硫酸盐测序PCR的方法证 一步利用双荧光报告基因检测发现，miR．520e的cpG岛区具有启动子活性。因此， miR．520e DNA超甲基化是导致miR-520e表达下调的原因之一。然后，我们对 和克隆形成等实验方法，发现在肝癌细胞转染miR．520e和在正常肝细胞中转染 miR．520e是否具有潜在的治疗作用，采用在接种肝癌细胞HepG2的荷瘤裸鼠的肿 在肝癌治疗中有潜在的应用价值。上述结果表明，miR．520e是一个新的抑癌 miRNA。 摘要 第二部分：miR-520e抑制肝癌细胞生长作用的分子机制 通常miRNA通过其靶基因实现功能，为了阐明miR．520e抑制肝癌细胞生长 作用的分子机制，我们对miR-520e的靶基因进行了探讨。运用生物信息学方法 分析发现，核因子1(B诱导激酶(NF．1cB．inducing 潜在靶基因。利用双荧光报告基因、RT-PCR、real．timePCR和免疫印迹实验发 达，并且与miR．520e的表达呈明显负相关，提示miR．520e可能通过其靶基因NIK liver中同时转染miR-520e抑制剂和NIK 发挥抑癌作用。研究发现，在肝细胞Chang 的siRNA时，NIKsiRNA可以逆转miR．520e抑制剂导致的促进肝细胞生长的作 用，支持了miR．520e可通过靶向NIK发挥抑制肝细胞生长的作用。进一步研究表 可通过抑制NⅨ．ERKl／2-NF．KB信号转导通路发挥抑癌功能。 第三部分：miR-520e在HBx促进肝癌细胞增殖中的作用 细胞系HepG2．X和稳定表达HBx肝细胞系L．02．X中均呈下调表达。应用RNA 干扰沉默HBx 参与了HBx的促肝癌细胞增殖作用。应用MTT检测发现，在HepG2一X肝癌细 胞系和L．02．X肝细胞系中过表达miR．520e，可阻断HBx的促肝癌细胞增殖的 作用。应用生物信息学方法进行分析，结果显示丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶2 kinasekinasekinase (mitogen．activatedprotein 2，MEKK2)是miR一520e的一个潜 在的靶基因。双荧光报告基因检测结果表明，miR．520e可以直接靶向MEKK2 MEKK2 靶基因。为了进一步探讨MEKK2是否参与miR．520e对肝癌细胞增殖的抑制作 促进肝癌细胞的增殖，miR．520e通过其靶向MEKK2发挥作用。 II 摘要 肝癌的作用及其分子机制研究具有重要的理论意义和潜在的应用价值。 关键词： miR．520e，肝癌，DNA甲基化，乙型肝炎病毒X蛋白，细胞增殖 III Abstract Abstract oneofthe Hepatocellular mostcommon