疾病代谢物色谱-质谱分析方法研究.pdf

复旦大学博士论文 摘 要 近年来，随着人类基因组测序工作的完成，人们对生命过程的理解有了很大的 提高；人类越来越关注自身的健康状况以及生命质量。在科学领域，研究的热点 也由此转移到基因的功能和几个“组学研究，包括研究核糖核酸(RNA)转录过程 的转录组学、研究某个过程中所有蛋白及其功能的蛋白组学、研究代谢产物的变 化及代谢途径的代谢组学。 代谢组学是继“基因组学、“转录组学”、“蛋白组学之后新兴的又一门“组 学研究。代谢物组中，有一类异常新陈代谢物与疾病息息相关。正如大自然中 生物个体之间和生物体内部的化学联系是一个普遍规律，人体内部也时刻通过生 物化学信号物质进行联系。当人体发生疾病时，新陈代谢相应出现异常，血液、 尿液、组织以及呼吸气体中会相应出现异常代谢物，而疾病化学标志物顾名思义 就是可以作为指针与疾病各个病理阶段相关联。分析这些疾病相关的化学信号物 质已经成为临床诊断疾病的一种重要手段。生物医学研究结合分析化学、生命科 学、医学等学科进行人类重大疾病的筛查、诊断、治疗已成为当前研究的热点。 发展色谱质谱新技术新方法发现并分析人体生物化学信号物质对重大疾病进行 筛查和预警已经成为其重要的方向之一。 本论文以重大疾病(糖尿病、肺癌、新生儿遗传代谢疾病等)血液和组织中 疾病化学标志物分离和鉴定为研究内容。该研究有十分重要的理论和现实意义。 对肺癌病人的血液进行固相微萃取GC—MS顶空分析，发现并论证肺癌标记物分 子，为肺癌开辟了一条新的、能够用于早期诊断的途径；并进一步发展了液滴衍 生微萃取技术与GC．MS联用技术，分析癌症以及新生儿遗传代谢疾病病人血液、 尿液中小分子代谢物，首次发现了癌症潜在早期标志物——己醛和庚醛；通过肝 病不同阶段的病理模型以及随访跟踪病人，运用该方法进一步论证了己醛和庚醛 作为癌症早期预警信号物质的作用。而对于新生儿遗传性有机酸尿症，我国儿童 医学在新生儿筛查此类病症方面一直处于空白，我们运用了液滴微萃取技术与 GC．MS联用，应用于几类典型的新生儿有机酸尿症研究，结果表明该方法快速 简便，定量准确，是潜在的临床早期筛查手段。 本论文共分四章。主要内容摘要如下： 第一章论述了代谢组学的定义、研究范畴以及在药学、微生物学、毒理学、 临床学等各方面的广泛应用与重要性。阐述了人体疾病信号物质研究对于重大疾 病早期诊断和预警的理论和实际意义。此外还综述了疾病化学信号物质的分析方 法，复杂体系样品前处理的方法以及建立合适动态模型的重要性和必要性。提出 了本论文的研究目标和选题意义。 第二章的工作中，首先发展了色谱质谱技术分析重大癌症以及肝病的生物标 复旦史学博士论文 志物，初步建立了早期筛查与预警癌症与肝病的简单、可靠的方法。发展了顶空 固相微萃取方法分析病人血样中挥发性小分子代谢物；针对小分子羰基化合物， 比较多种衍生试剂，进一步发展了定量分析小分子醛酮化合物的原位衍生化固相 微萃取GC．MS方法，首次发现了癌症病人血液中己醛与庚醛含量异常，为正常 人血液中含量的10倍以上，我们认为己醛与庚醛为癌症病人体内代谢异常的标 志指针。我们通过建立不同阶段肝病病症的病人模型，动态跟踪随访病人，分析 病人血液中小分子醛酮的含量，进而验证了己醛及庚醛与癌症的相关性。衍生固 相微萃取与GC-MS方法联用，具有快速、无害、简单、准确的优点，解决了传 统方法难以准确定量分析挥发性强的小分子羰基化合物的问题。 第三章在第二章原位衍生固相微萃取技术的基础上，进一步发展了液滴衍生 微萃取技术与GC．MS联用分析重大疾病血样中小分子羰基化合物。论文首先综 述了近年来液液(微)萃取技术的发展与应用，设计了简便的液滴微萃取设备并 与固相微萃取技术进行比较，两者各有其优缺点。固相微萃取无需有机溶剂、对 环境友好，但缺点是成本较高、萃取头容易损坏、进样易残留；液滴微萃取技术 与其相比优点是成本低廉、毒性溶剂仅使用微升级别可忽略不计，集萃取、衍生、 进样于一步骤，缺点则是与固相微萃取相比操作需要训练，该方法适用于大量样 本筛查，大大降低成本。本章发展了一系列液滴萃取方法：(1)液滴微萃取溶液 内衍生化．GC／MS分析癌症病人血液中羰基化合物，试验结果与固相微萃取技术 可较好吻合，检测限略高，但足够满足血样中实际浓度分析。(2)液滴内衍生微 萃取．C-C／MS分析癌症病人羰基化合物标志物，将衍生试剂先溶入萃