张洪英博士讲课课件。甲型H1N1流感标本采集、运送、保存、和检测.pptVIP

病毒分离成功很大程度上取决于临床标本的质量，及其保存、运输等环节； 多数标本取自患者上呼吸道鼻咽腔，其次为气管和支气管分泌物及尸检组织； 标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存； 常用的采样液有三种：Hank’s、Eagle’s、生理盐水； 5. 样本要求 呼吸道样本包括：支气管肺泡灌洗液，气管抽提物、痰，鼻咽或口咽洗液或拭子。拭子样本所用的拭子顶端应为人造材质（如聚脂或涤纶）、柄为铝制或塑料。不推荐使用棉头木柄的拭子。藻酸钙拭子采样不可取。 6. 排除标准： 未在2-4°C (≤4 天)或-70°C及以下保存的样本；以上未列的其它不当样本。 实验材料 试剂: 1. 一步法荧光定量RT-PCR探针 (例如, Taqman?) 试剂盒；Invitrogen SuperScript?III Platinum? 一步法定量试剂盒 (cat# 11732-020或11745-100)； 2. 分子级无菌蒸馏水 (无RNA酶和DNA酶)；3. 正反向引物 (40μM)；4. 双重标记探针(10μM)；5. 阳性对照。 供给: 2. 实验室标记笔；2. 微量离心管格栅，96孔0.2mlPCR反应管；3. 20μl 和 200μl 可调节移液器及滤芯枪头；4. 0.2ml PCR 反应管盘；5. 光学反应盖板；6. 无菌,无核酸酶的1.5 ml微量离心管；7. 一次性无粉手套。 仪器设备: 3. 微量离心机；2. 漩涡振荡器；3. 实时荧光定量PCR检测系统，含96孔的热循环反应板。 操作程序 准备工作: 1. 避免样品污染 由于fluorogenic 5’核酸酶测定的敏感性，应特别注意假阳性产生。 推荐以下预防污染的方法： (a) 实验准备与核酸提取使用独立区域； (b) 实验准备与核酸提取使用专用设备（如移液器，微量离心机）和耗材（如微量离心管，吸头）； (c) 实验开始后穿清洁工作服，并使用新的一次性无粉手套； (d) 不同样本操作之间，以及怀疑可能污染的情况下均更换手套； (e) 试剂和反应管的盖子应尽量关闭。 2. 仪器准备 工作台、移液管、离心机必须清洁，用去污剂净化，例如5%的漂白剂、“DNAzapTM”或者“RNase AWAY?”来减小核酸交叉污染的风险 操作程序 准备工作: 3．试剂准备 注意：在试验过程中，保持所有的试剂在冰架上保持低温。 （a） 引物和探针 ?? 分装好的冰冻的引物和探针进行融化（已融的探针避光2-8℃可保存多达 3个月，不要对探针反复冻融）； ?? 涡旋振荡引物和探针； ?? 瞬时离心引物和探针，之后置于冰架上。 （b） Real time RT-PCR的试剂 ?? 将Master Mix和酶置于冰架上； ?? 融化2×的Reaction Mix； ?? 颠倒混合2×的Reaction Mix； ?? 瞬时离心2×的Reaction Mix和酶，置于冰架上。 操作程序 准备工作: 4．对RT-PCR的每一步过程均进行检测 1）.每个样品的RNA提取物通过分别的引物和探针进行检测：InfA, swFluA,Swine H1 (swH1) 和RNaseP (RP)。RNaseP引物和探针是以人的RNaseP基因为靶基因的，因此对于人的核酸可以作为内部阳性对照。 2）.对于每一个过程中包括的所有引物和探针，均设立无模板对照（NTC）和阳性模板对照（PTC）。 3）.人类样本对照（HSC）提供了次级阴性对照，以便确认核酸提取过程和试剂的完整性。 目的： 对采集的可疑病例标本进行检测，筛选甲型H1N1 流感病毒并排除季节性H1N1 流感病毒。 方法： 1、荧光定量RT-PCR； 2、一步法RT-PCR； 为了我们的明天更加美好！ 本文观看结束！！！ * 南京市疾病预防控制中心 张洪英 甲型H1N1流感标本的采集、运送、保存和检测 内　容 一、概述 依据：《流行性感冒诊断标准》 ws285-2008 附录G，P29 内　容 一、概述 依据：《甲型H1N1 流感病毒实验室检测方法》中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家流感中心。 更新时间：2009 年5 月3 日 5pm，概述部分 内　容 二、采样方法 依据：《流行性感冒诊断标准》 ws285-2008 附录G，P29 内　容 三、运送、保存标本 依据：《流行性感冒诊断标准》 ws285-2008 附录G，P29 内　容 四、血清标本 依据：《流行性感冒诊断标准》 ws285-2008 附录G，P30 内　容 五、核酸检测 （一）材料 依据：《甲型H1N1 流感病毒实验室检测方法》中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家流感中心。 更新时间：2009 年5 月3 日 5pm，实验材料部分 内　容 五、核酸检测 （二）