CBLB502生物的构建及活性研究.pdf

摘要 摘要 随着经济全球化日益增长，爆发大规模国际冲突和核战争的风险大大降低， 但是许多国家一直在寻求发展核武器的能力，而且全世界目前仍有30000多个核 弹头，因此爆发核战争危险仍然存在。另外，以“脏弹’’为手段或攻击核电厂、 核废料处理工厂等恐怖袭击的风险也是许多国家最关心的问题。2011年，日本 福岛核事故提醒我们目前还存在另一个潜在的，具有威胁性的辐射源。由于目前 还没有被批准的保护人类免于急性辐射损伤的药物，因此寻找应对这些威胁的对 策是极其期待的。 2008年，CBLI公司(ClevelandBioLabs，Inc．)开发了一种先导化合物 CBLB502(以下简称AA’)，即鼠沙门氏杆菌鞭毛蛋白的衍生物，该衍生物能够 特异性识别TLR5并激活NF．r．B信号通路。由于在细胞中，NF．rB信号通路的 活化可以有效抑制细胞凋亡的发生，因此在辐射之前，单一剂量注射AA’，能有 Radiation 效保护小鼠胃肠道和血液系统免受急性辐射并发症(Acute Syndrome， ARS)的发生，将小鼠的存活率最高提高80％。 尽管前期的体外和动物实验表明AA’是一种潜在的高效辐射防护剂(辐射之 前注射)和辐射损伤缓和剂(辐射之后注射)，而且其免疫原性和毒性均低于全 长的鞭毛蛋白，但是因其来源于鞭毛蛋白，因此仍旧含有一定的免疫原性与毒性， 事实上注射后会造成“flu．1ike”并发症的发生。 在本研究中，我们旨在开发一种比AA’分子量更小、免疫原性与毒性更低， 活性更高和生产更加方便快捷的衍生物。基于“蛋白结构域是蛋白折叠和活性的 基本单元的假设和对鞭毛蛋白结构的分析，我们构建了截短形式的AA’突变体， 该衍生物仅保留完整的TLR5结合结构域A、A’及中间的连接肽，将其命名为 △AA’，分子量仅为AA’的3／4。我们前期重组表达实验结果表明：在Kcoli中， 约90％以上的厶认’是以可溶形式表达，与约80％的AA’以包涵体表达几乎完 全不同，可溶性的明显增加，将为出认’的纯化和工业生产带来极大的方便。 同时，为了获得比AA’活性和稳定性更好的衍生物，我们利用了分裂型Npu DnaE内含肽介导体内蛋白首尾环化的策略。首先，我们利用EGFP作为报告系 I CBLB502衍生物的构建及活性研究 其热稳定性比线形EGFP提高了4．--,5‘C。这些结果表明N?uDnaE内含肽能够高 DnaE 效环化EGFP，并能够增加Cyc．EGFP的热稳定性。随后，我们组建Npu 内含肽／hA’、N?uDnaE内含肽／出认’融合表达载体，并在大肠杆菌中最终获得了 Cyc．AA’与Cyc．△AA7，其剪接、环化效率与EGFP相当。上述结果也提示Npu DnaE内含肽对外源蛋白就有较高包容性，可能是一种通用的高效介导蛋白首尾 环化的分裂型内含肽。 在大肠杆菌中成功诱导表达AA’，△AA’，Cyc．从’和Cyc．讹～，后，通过三 步连续的纯化方法对重组产物进行了纯化，它们依次为镍柱亲和层析、离子交换 是出认’、Cye．AA’和Cyc．饿～’的纯度均低于90％，随后我们利用荧光素酶报告 检测系统对纯化的样品进行细胞活性分析。结果表明：△AA’活性高于AA’， Cyc-AA’、Cyc．△AA’分别比相应的线形AA’、出执’活性要高，这或许表明环化是 增强线形蛋白活性和热稳定性的通用方法。 以上结果表明：△从’，Cye．△AA’可能成为以后体内，体外进一步活性检测 及临床研究的较好的药物候选分子。 关键词：辐射防护，CBLB502，蛋白环化，分裂型内含肽，蛋白稳定性 Abstract Abstract Asthe economic tooutbreak daily possibility global