ZEB1在大鼠肝星状细胞激活与转分化中作用.pdf

中的作用………1 3 前言…………………………………………………………1日IJ舌…………………………………………………………0 4 材料与方法…………………………………………………l3 5 结果…………………………………………………………23 石 讨论…………………………………………………………30 7 结论…………………………………………………………34 ●_工，_■，-▲1●_．●I_l，上 盘 参考文献……………………………………………………35 1．9 英汉缩略词对照表…………………………………………39 2 致{射…………………………………………………………40 3 MicroRNAs在未分化甲状腺癌侵袭转移中的调控作用…41 I ＼＼㈣嬲 ZEBl在大鼠肝星状细胞激活及转分化中的作用 摘 要 ’ 目的：本实验中利用ELISA、MTT和Western Blotting等实验检测 的方法，探究ZEBl在肝星状细胞激活及转分化中的作用，并通过刺 激肝星状细胞活化的方法来观察TGF．D信号通路的功能及效应。证明 乙醛刺激肝星状细胞能上调ZEB1的表达进而使肝星状细胞激活并转 1 分化。方法：首先，采用SB．43 542特异性阻断TGF．p信号通路结合 乙醛刺激HSC细胞，Western 1、0c．SMA、Smad3 blotting检测HSC内ZEB 和P．Smad3．$425的表达。接着乙醛刺激肝星状细胞并设置不同的刺激 时间，可通过MTT法来检测活化肝星状细胞的增殖水平；通过ELISA 法测定肝星状细胞内纤维粘连素FN以及胶原蛋白I含量，①将细胞株 刺激培养，(8)乙醛36d,时刺激培养。培养相应组的细胞到细胞融合 度为70％至80％时，用胎牛血清含量为0．4％的DMEM培养基培养12 小时即是对各组细胞进行了同步化处理，之后再用胎牛血清含量为 1542最终浓度是 是2009mol／L)前先用对应的抑制剂(SB．43 109mol／L)预处理1小时，刺激满12d时补加一次乙醛刺激。然后， 收取细胞，对细胞总蛋白进行提取，用G250法测定细胞中总蛋白的 含量，‘SDS．PAGE电泳对蛋白进行分离以及用Western Blotting检测 One 软件进行处理和分析，根据Western膜上的蛋白条带相应灰度值进行 比较分析。②HSC．T6细胞株分组仍然同上。将HSC．T6细胞株接种到 96j：L培养板中，每组设有3复孑L，随后的细胞同步化和相应试剂处理 也同上。各组细胞处理完毕后，细胞生长的情况即可通过光镜进行观 察，并通过ELLSA法检测胶原蛋白I和纤维粘连素FN的含量变化， 以及利用MTT法检测细胞活性变化。结果：①正常培养对照组HSC 均有明显的抑制作用。②肝星状细胞经乙醛刺激后可被激活，激活表 现为：胶原蛋白I和纤维粘连素FN在ELLSA法检测中含量均有一定 的增加，用MTT法检测出细胞增殖活性明显增强。说明乙醛可刺激肝 星状细胞的激活。加入阻断剂后，MTT测定结果显示细胞活性明显下 调，I型胶原蛋白(TIⅧI)和纤维粘连素(FN)含量也明显下调。 ③不同刺激时间比较得出：各项指标的改变随刺激时间延长逐渐增 高，至24h达到最高峰，36h略有下降。结论：①乙醛对大鼠肝星状细 胞的激活有明显的刺激作用，转录因子ZEBl的表达显著上调，HSC 细胞大量增殖并转分化。②乙醛激活肝星状细胞的增殖及转