《显微标本制作技术》.pptVIP

显微标本制作技术 1665年英国显微镜学家R·胡克把软木切成薄片才在显微镜下观察到细胞。 列文虎克在1714年用藏红花作肌纤维切片的染色，这一简单的切片和染色可以说是制片技术的萌芽。 经过100多年的实践，至19世纪中期显微制片技术才逐渐完善。1863年W·瓦尔代尔报告了用苏木精染色可以很好地显示染色体。1869年E·克莱布斯最先采用石蜡作为切片支持物来包埋材料。两年后，波姆和斯特里克勒把它发展为石蜡切片法。虽然早在1770年英国人卡明斯设计制作了切片机，但完善的转动式切片机直到1883年才由法伊弗在美国制造成功。这些重要的制片手段，至今仍在使用。 一、实验原理 显微标本的制作技术是组织学，胚胎学，生理学及细胞学等学科研究观察细胞、组织的生理、病理形态变化的一种主要方法。大多数的生物材料，在自然状态下是不适合显微观察的，也无法看到其内部结构。因为材料较厚，光线不易透过，以致不易看清其结构，另外细胞内的各个结构，由于其折射率相差很小，即使光线可透过，也难以辩明。但在经过固定，脱水，透明，包埋等手续后就可把材料切成较薄的片子，再用不同的染色方法就可以显示不同细胞组织的形态及其中某些化学成份含量的变化，就可以在显微镜下清楚的看到其中不同的区域组分状态，切片也便于保存，所以是教学和科研中常用的方法。 二、实验方法 生物显微制片有许多不同的方法，一般可分为非切片法与切片法两大类： 非切片法有涂片、铺片、压片、磨片、整装片等。 切片法又包括徒手切片、石蜡切片、半薄切片及超薄切片、冰冻切片、火棉胶切片 显微制片技术虽是生物学中很基本的操作技术，但由于生物材料的个体差异，化学试剂的多样性，因此操作技术相当细致而复杂，方法也很多，每一步骤的失误都可导致整体的失败，因此需要耐心细致，不断总结经验，才能得到较好的结果。 即不用切片机，不经切片手续而制成切片的方法，根据材料性质的不同，有不同的处理方法，该类方法操作简单快捷，其中铺片法，封藏法可使原有组织结构不被破坏，涂片法，压片法弥补了用包埋，切片法所不可能观察清楚的不足，因此是显微标本制备的中常用的手段。 1.2 铺片法 主要用于动、植物组织的表皮层观察，可活体取待观察动、植物组织，用尖镊子撕去一层表皮，迅速平铺在载玻片上。 如: 洋葱表皮细胞的铺片制备。 1.3 压片法 一些较幼嫩，柔软的材料可将其置载玻片上，用小解剖刀将其分散，加染料一滴，再盖上盖玻片，用拇指垂直用力挤压，使组织散成一薄片，再进行观察，如植物根尖观察染色体，花粉粒观察发育阶段等。 1.4 离析法 该方法是利用化学试剂使组织的细胞间质溶解，使细胞能分散成单个个体。经染色，脱水，透明即可观察其个体形态，适用于肌肉，叶片，茎等部位。 1.5 磨片(Ground section) 用于很坚硬的组织，如骨和牙。 2 、切片法 切片法是必须依靠手或切片机将组织切成薄片来进行观察的方法，为了能清晰地观察到动、植物的组织结构及细胞形态，必须先经过一系列步骤将组织内渗入某些支持物质，使组织变硬以利于切成薄片，根据所用支持剂的种类不同，可分为徒手切片法，石蜡切片法，火棉胶切法，冰冻切片法等类型，切成薄片后还需要去蜡，染色，脱水，透明等步骤，将其制成永久标本。 1.徒手切片:尽量切薄,切一层细胞,此法多用于植物切片的临时观察。 2.石蜡切片：4-12μm厚，用石蜡浸透到组织中，并包埋组织，用旋转切片机把蜡块切成薄片。 3.半薄切片：0.5-1μm厚，用树脂包埋。用途:在光镜下观察尽量薄；为超薄切片定位，因为其制片技术和超薄切片一致。 4.冰冻切片：使组织内部及周围的水份结冰，组织变硬，然后用切片机切成薄片，制成切片，此法制作步骤少，用时短，不经脱水和透明，故对脂类无影响。常用于临床快速病理分析。 5.火棉胶切片：用火棉胶包埋组织，滑行切片机切成薄片，主要用于大块组织切片。 徒手切片法是指手拿刀片把植物新鲜材料切成薄片，所作的切片通常不经染色或经简单染色后，制成临时的水装片用于观察，亦可以通过脱水与染色制成永久制片。 优点：简单、方便；不需要复杂设备；不经化学药物处理，基本上保留了植物活体的状态。有一定局限性，但至今在生物学教学中仍然是观察形态构造的一种基本切片方法 。 作徒手切片不需要复杂的设备，只需要一把锋利的剃刀或双面刀片就可以进行，方法简单，而且易于保持细胞的生活状态。徒手切片法所作的切片通常不经染色或经简易染色后，封藏于水中即可观察。用剃刀切片，材料不能太大，一般以表面不超过3-5mm为宜。切片最要紧的是平而薄，无需很完整，比如茎的横切面，无需切片整圆形，只需一角就够了。所有切片前的准备工作