《浅析双向凝胶电泳的样品制备》.docVIP

浅析双向凝胶电泳的样品制备 信息来源：《生物产业技术》 ?? 作者：应天翼 ?? 发布日期：2010-11-08 ? ? 摘要：对于双向凝胶电泳实验来说最重要的环节就是样品制备，样品的好坏直接关系到整个实验最终的成败。本文将对样品制备进行简要的阐述，并以大肠杆菌细菌为例介绍具体的制备步骤。 关键词：双向凝胶电泳；样品制备；大肠杆菌 ? 样品制备对于获得理想的结果是至关重要的，但是由于所研究的实验对象不同、采用的技术手段不同、需要达到的目标不同，所以迄今为止并没有一个理想的实验方案能够解决所有问题。由于在目前双向电泳技术仍然是蛋白质组学研究的一个主要技术手段，所以本章将围绕如何制备双向电泳所需要的样品来展开讨论。 ? 1 样品制备的原则 （1）要注意样品的准确性问题：第一，样本是否处于所需要的状态？例如在研究某种疾病的时候，所要采集的组织是发病的哪个阶段（早期、中期、或者晚期）。第二，采集的样本是否单一？例如在采集肝脏组织的时候是否带有大量血管。 （2）要避免蛋白质的丢失：样品制备的操作步骤越少、时间越短越好，这样能有效地减少蛋白质的特异性和非特异性丢失。 （3）要避免蛋白质的修饰和降解：使用高质量的试剂，操作尽可能保持低温、快速。 （4）样品中的杂质要尽量少：尽可能地除掉脂类、多糖、核酸、盐分等能够对后续实验造成干扰的杂质。 ? 2 裂解液 在样品制备过程中都需要用裂解液来溶解并提取蛋白质，基本组分有离液剂、表面活性剂、还原剂等物质，一般来说裂解液有以下几方面的作用［1］： （1）将所有蛋白转化为单一构象。 （2）去除氧化步骤。 （3）防止蛋白质的沉淀。 （4）防止蛋白质的修饰。 （5）使疏水蛋白质充分并稳定地溶解。 （6）灭活蛋白酶。 （7）破坏二硫键和疏水键，充分暴露其内部基团。 ? 离液剂 高浓度的尿素通过破坏蛋白质的二级和三级结构来使疏水蛋白溶解并防止其蛋白质之间的相互作用，硫脲可以增加一些难溶的疏水蛋白质（如膜蛋白）的溶解。单独使用尿素时浓度至少8M（最高可到9.8M），而硫脲的溶解性不好（通常最高2M），所以在一同使用的时候通常尿素的浓度是5-7M，而硫脲是2M。含有尿素的溶液在操作时一定要注意控制温度，温度过高（37）会造成分解，而温度过低可能造成析出。从加水溶解开始，尿素就会在溶液体系中逐步和氰酸铵达成一定的平衡。在37以下，尿素的水解很缓慢，对于绝大多数的样品制备程序都不会造成影响。异氰酸会与蛋白质的N末端、赖氨酸、精氨酸的氨基以及半胱氨酸的巯基发生氨甲酰化反应，分子量增加43，反应原理见图1。这些反应的速度依赖于pH值，与脂肪族胺反应的最适pH值是8.5-9.5，而与蛋白质N端的α氨基反应最适pH值为7左右。如果异氰酸修饰了蛋白质的氨基，那么蛋白质所携带的正电荷减少，在2D图谱上会产生向酸性端的偏移。温度不是很高的情况下，会在原蛋白质点偏酸的位置出现横向成串的点。温度过高时，则蛋白质点会聚集在酸性端。由于分子量只增加43，所 以观察不到纵向上的变化。 ? 表面活性剂 表面活性剂通过破坏离子键和氢键防止蛋白质通过疏水作用聚集，促进但蛋白质的分散和溶解。最初使用的是非离子型的Triton X-100（质谱对于Triton X-100中的杂质非常敏感）和NP-40，然而由于两性离子表面活性剂CHAPS（通常最高使用浓度4%）可以获得很高的纯度，所以得到了广泛的应用。后来又陆续研制出一系列的新型两性离子表面活性剂，如SB 3-10（由于SB 3-10在尿素溶液中不容易溶解，所以一般要求尿素浓度最高5M）、ASB14、C8?等［3］。阴离子型的SDS有时也会使用，主要是为了防止寡聚体的形成（如血清中的白蛋白）和溶解一些难溶的疏水蛋白。通常最高使用浓度为2%，但是在等电聚焦（IEF）前必须稀释至少20倍以上（即稀释到0.1%）。通电后SDS会与蛋白分离，并电泳到阳极端。当SDS不能从蛋白上分离开的时候，会使等电点变得更酸。表面活性剂的作用是同所使用的离液剂体系密切相关的。一般来说兼性离子表面活性剂比中性的好，但是也有例外。有报道显示当单独使用尿素的时候，CHAPS比Triton X-100好，但是当使用尿素-硫脲体系的时候，Triton X-100溶解膜蛋白就要比CHAPS好很多［4］。 ? 还原剂 为了使许多蛋白质达到完全的去折叠还需要还原二硫键。最初使用β-巯基乙醇，但是由于使用浓度较高，在pH8时存在一定的缓冲作用，且经常存在角蛋白污染，所以后来经常使用的是巯基型的二硫苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇（DTE）和非巯基型的三正丁基膦（TBP）［5］。在IEF的时候，由于DTT、DTE会带有负电荷，所以造成流失，不能很好地维持还原的环境。TBP由于不带电荷而被普遍认为是一种较好的替代品。 ? 蛋白酶抑制剂 细胞中