植物生理学实验植物呼吸酶的测定.docVIP

植物呼吸酶的测定 植物体内的呼吸酶，是催化植物在呼吸过程中，进行氧化还原的一些酶类。植物体内的末端氧化酶是将从基质传递来的电子，直接交给氧并产生H2O或H2O2。植物体内的末端氧化酶有抗坏血酸氧化酶、多酚氧化酶等。这个复杂的氧化酶系统，有助于植物对不良外界环境条件的适应。 通过本实验，掌握一个简便快速测定抗坏血酸氧化酶及多酚氧化酶活性的方法1. 抗坏血酸氧化酶 抗坏血酸在抗坏血酸氧化酶的作用下，可以氧化为脱氢抗坏血酸。 抗坏血酸为底物，加入酶的提取液，酶与底物充分反应，此时抗坏血酸氧化酶将抗坏血酸消耗掉一部分，根据消耗的多少来计算酶的活性。抗坏血酸消耗的多，说明酶的活性强。 抗坏血酸的消耗量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来测定 I2 的产生： KIO3 + 5KI + 6HPO3 → 3I + 6KPO3 + 3H2O? 用碘液滴定剩余的抗坏血酸： ?2. 多酚氧化酶多酚氧化酶在有氧存在的条件下，可以将酚氧化成醌 邻醌再与抗坏血酸作用，将它氧化成脱氢抗坏血酸。 上述反应，由于醌类物质的氧化还原电位比抗坏血酸的高（邻醌△ E=0.696 ，抗坏血酸△ E=0.166 ）。所以邻醌能夺取抗坏血酸上的氢，生成邻苯二酚。因此，多酚氧化活性的测定，参加反应的底物有两种：即邻苯二酚和抗坏血酸。多酚氧化酶的活性，也用抗坏血酸的消耗量求得。 二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料 （二）试剂 1 ． pH 6.0 的磷酸盐缓冲液： A 液为 1/15 mol/L 磷酸氢二钠溶液， B 液为 1/15 mol/L 磷酸二氢钾溶液，取 A 液 10 mL 与 B 液 90 mL 混均即可。 2 ． 0.1 ％抗坏血酸，试验当天配制。 3 ． 0.02 mol/L 焦儿茶酚邻苯二酚 ：称取 0.22 g 焦儿茶酚溶于 100 mL 水中 , 试验当天配制。 4 ． 10 ％HPO3 ）。 5 ． 1 ％淀粉溶液。 6 ． 0.005 mol/L 碘液：碘化钾 2.5 g 溶于 200 mL 蒸馏水中，加冰醋酸 1 mL ，再加 0.1 mol/L 碘酸钾（ 0.3567 g 碘酸钾溶于水，定容至 100 mL ） 12.5 mL ，最后加蒸馏水成 250 mL 。 （三）仪器设备 研钵 1 个容量瓶 50 mL 1 个三角瓶 50 mL6 个微量滴定管移液管 5 mL1 支、 2 mL 2 支、 1 mL1 支 恒温水浴三、实验步骤 1. 酶液的提取取g ，放入研钵中，加少量石英砂，加 pH 6.0 的磷酸盐缓冲液约 5 mL ，迅速研成匀浆，研碎后迅速放入 50 mL 容量瓶中，把全部材料都用蒸馏水洗入 50 mL 容量瓶中，最后用缓冲液定容至刻度。 在室温下，每隔 3 min 摇动一次，共摇 5 次，共计 15 min ，再静止 20 min ，其上清液即为酶的提取液。 2. 酶活性的测定取 6 个 50 mL 干净干燥的三角烧瓶，标上号码，除酶液外，按准确加入各试剂： 表 酶活性测定加入的各试剂量 瓶号 抗坏血酸 焦儿茶酚 偏磷酸 酶液 偏磷酸 备 注 1 4 2 1 测抗坏血酸氧化酶 2 4 2 2 测抗坏血酸氧化酶 3 4 2 2 空白测定 4 2 1 2 1 测抗坏血酸氧化酶及多酚氧化酶 5 2 1 2 1 测抗坏血酸氧化酶及多酚氧化酶 6 2 1 1 2 空白测定 先在各瓶中加、抗坏血酸及焦儿茶酚，并向 3） 及 6） 号瓶加入 1 mL 偏磷酸准确记录加入酶液的时间。反应 3 min 后立即烧瓶中加入偏磷酸 1 mL ，停止酶的活动。然后加入 3 滴淀粉溶液做指示剂，用 0.005 mol/L 碘液滴定。滴定到出现浅兰色为止。记录消耗碘液的数值。 四、结果计算 酶活性以每克鲜组织，每分钟氧化抗坏血酸的毫克数表示。计算方法如下： 抗坏血酸氧化酶 式中： 0.44 ——每毫升 0.005 mol/L 碘液氧化抗坏血酸毫克数。 多酚氧化酶由于多酚氧化酶提取液中有两种酶4）瓶与5）号瓶中又有两种底物，所以4）号瓶与5）号瓶中包括两种酶的活性，在求多酚氧化酶的活性时必须减去抗坏血酸氧化酶的活性。 多酚氧化酶