实时定量PCR技术原理及应用课件.ppt

聚合酶链式反应技术及其应用 提 纲 第一节 聚合酶链式反应扩增原理 第二节 PCR反应体系和循环参数的优化 第三节 PCR反应的问题与对策 第四节 一个常规PCR实验的设计 第五节 聚合酶链式反应技术类型 第六节 聚合酶链式反应技术应用 聚合酶链反应 (Polymerase Chain Reaction ,PCR) 聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是近十几年来发展和普及最迅速的分子生物学新技术之一。由于它具有强大的扩增能力，并且可与其他分子生物学方法(如核酸杂交)和免疫学方法(如ELISA)相结合应用，使其敏感性和特异性都大大增强，因而广泛地应用于生物医学领域的各个学科，包括基因的克隆、修饰、改建、构建cDNA文库，遗传病，传染病的诊断，法医学鉴定，物种起源，生物进化分析，流行病学调查，等等。由于PCR对世界生物医学研究的巨大推动作用，其发明者Mullis因而获得1992年诺贝尔医学奖。 最早报道的PCR是用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 经枯草杆菌蛋白酶处理后获得的Klenow片段来 催化DNA链的延伸。由于加热变性时酶会失活， 需要补加一份酶催化下一轮合成。这样不仅操 作复杂,而且由于酶反应的温度较低，DNA分子 会产生二级结构或引物非特异退火，使反应效 率低且易出现非特异性产物，同时，会增加污 染的机会。耐热DNA聚合酶的应用使PCR得以完 善。这种酶在加热95℃时不会变性，引物退火 和链的延伸可以在较高的温度下进行，因而使 得PCR的产率和特异性都大大提高。 PCR技术问世后，不仅迅速在生物医学领域得到广 泛应用，而且不断衍生出许多新的技术，使其应用范围 不断扩大，特异性和敏感性也不断提高。 比如反转录PCR(RT-PCR)是以mRNA为模板，通过 反转录反应合成cDNA，再做PCR扩增，因而可检测特异 的mRNA或得到其cDNA克隆； 如果仅有很少的序列资料，可通过锚式PCR对RNA 进行分析； 差异显示PCR（DD-PCR）可以鉴定和分离在不同条 件下(如机体或细胞受某种刺激或疾病时)某些有表达差异 的基因，而无需确切的序列资料； 免疫PCR是将PCR的强大扩增效力应用于免疫学检测 中，与传统方法相比其灵敏性要提高几个数量级； PCR- ELISA则是将PCR与核酸杂交、ELISA连为一 体，用ELISA鉴定PCR产物，避免了因使用Southern Blotting所带来的放射性污染等等。 第一节 聚合酶链式反应扩增原理 PCR是利用耐热DNA聚合酶在体外条件下，催化一对引物间的特异DNA片段合成的 基因体外扩增技术。它包括三个基本过程： DNA扩增量呈指数上升 反应最终的DNA扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。 Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示每次扩增效率的平均值，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。 反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应” ，这种效应称平台期。 第二节 PCR反应体系和循环参数的优化 （一）PCR反应体系 1、引物 2、耐热Taq DNA聚合酶 3、三磷酸脱氧核苷酸（dNTP） 4、镁离子 5、缓冲液 6、模板 7、去离子双蒸水 （二）循环参数 1、变性的时间和温度 2、引物退火的温度与时间 3、延伸时间和温度 4、平台效应 反应体系中的各种成分的浓度一般需要进行优化 处理，浓度过高或者过低都有可能对产物的特异性或 产率造成不良影响。现在市场上所售PCR试剂盒中， 通常将 Taq 酶、 dNTP、 镁离子、 PCR 缓冲液混合 在一起，并已经过优化处理，我们在进行实验时只需 要加入引物、模板及适量的去离子双蒸水即可，使用 起来非常方便，且