枯草芽孢杆菌B47菌株抗菌物纯化鉴定与对玉米小斑病防治作用.pdf

广西大学博士掌位论文 B47菌株抗菌物的纯化鉴定及其对玉米小斑病的防治作用 枯草芽孢杆菌B47菌株抗茵物的纯化鉴定及其 对玉米小斑病的防治作用 摘要 植物病害是导致农作物减产的重要因素，目前采用的化学防治方法已引起环境污 染等一系列负面效应，利用微生物产生的抗菌素防治植物病害具有对环境友好、能克 服环境因子影响等优点，在植物病害防治中起着越来越重要的作用。分离自番茄茎内 的枯草芽孢杆菌(Bacillus maydis)在内的多种植物病原菌的拮抗物质。本文在优化B47菌株高产抗菌物质的培 养基和发酵条件，以获得大量抗菌物质的基础上，对B47菌株的抗菌物质进行纯化 和鉴定，测定拮抗物质的理化性质、在玉米叶片上的作用方式、残留期和持效期及其 对玉米小斑病的防治效果，为B47菌株抗菌物的研发和应用提供理论基础，同时为 玉米小斑病的防治提供新途径。主要研究结果如下： 1．B47菌株高产抗菌物质的最佳碳、氮源和无机盐分别为蔗糖、酵母浸膏和 MgS04．7H20，通过正交试验法得到最优培养基配方为：蔗糖2％，酵母浸膏2％， 0．0009％。该培养基的营养组分和 O．06％，FeS04·7H20 牛肉浸膏1．5％，MgS04．7H20 Extract．Sucrose．BeefExtract) 含量与已报道的培养基不同，将其命名为YSB(Yeast 培养基。经比较发现，B47菌株在YSB培养基中培养，其抗菌物质的产量均显著高 于常用培养基NB、LB、BPY和KMB。 以YSB为培养基，在确定单因子的基础上，通过正交试验法对B47菌株高产抗 7．0，170 菌物质的发酵条件进行优化，得到最优发酵条件组合为：30℃，pH rpm振 mL／200 荡培养6d，接种量为l％，装液量为40 mL培养瓶。 2．经盐酸沉淀、甲醇萃取、硅胶柱层析、分子凝胶过滤层析和反相高效液相色 菌具有较强抑制作用的活性物质。纯化物的双缩脲反应呈阳性，茚三酮反应呈阴性， 但水解后呈阳性，推测其分子为环状结构的肽类物质。红外吸收光谱扫描结果表明该 物质分子构成中存在酰胺键的官能团N．H、C=O和C．N及脂肪碳链中的官能团C．H， g-西大学博士掌位论Jr． B47菌株抗菌物的纯化鉴定及其对玉米d、斑病的防治作用 表明纯化物是一种脂肽类物质。氨基酸组分分析得到纯化物的氨基酸种类和摩尔比约 A的氨基 Da。 MALDI．TOF．MS／MS CID质谱分析得纯化物的分子一级结构为 A2相同，将该物 质鉴定为脂肽化合物iturinA2。 3．对脂肽化合物iturinA2的理化性质进行测定，试验结果表明，iturin A2的热稳 min后，活性没有变化；经121℃高压处理20 定性好，100。C处理30 min后，活性仍 W、10 为对照的90．45％。iturinA2的光(紫外线)稳定性好，经紫外灯(40cm)照 射8h及阳光照射15d，其抑菌活性没有变化。此外，该物质对蛋白酶