海月水母响应环境低氧分子机制及研究.pdf

b 万方数据 I 万方数据 海月水母响应环境低氧的分子机制研究 摘 要 河口、海湾及近岸海域出现的低氧区和海洋中大型胶质类水母的暴发严重威 胁到渔业资源和海洋生态系统的健康。相对于其他海洋生物，水母类能够耐受低 氧并且频繁出现在低氧水域，但是对此现象的机制性研究并不多见，尤其未见有 关水母耐受低氧分子调控机制研究的报道。显然，要了解环境低氧与水母暴发的 相互关系，就必须对水母类响应环境低氧的机制进行深入研究。 针对水母类耐受低氧并且频繁出现在低氧水域的现象，本文以我国近海大型 水母— 海月水母为研究对象，通过构建低氧培养控制体系，以低氧诱导因子 （Hypoxia Inducible Factor, HIF ）为中心，对低氧环境下海月水母生理活性、有 关基因表达和代谢产物的含量进行测定、比较和分析，以期揭示水母响应低氧的 分子机制。研究获得的主要结果如下： 1、证实了海月水母细胞内存在低氧诱导因子基因 根据海月水母转录组测序获得了低氧诱导因子（HIF-1α）部分基因序列，通 过RT-PCR 和RACE 技术获得HIF-1α 基因2,466 bp 的全长cDNA，共编码675 个氨基酸。对蛋白质功能结构域分析表明，海月水母HIF-1α 含有bHLH 、PAS 、 NODD 、CODD 和CTAD 五个保守的功能结构域。以HIF-1α 全长cDNA 序列为 基础，通过克隆、测序、拼接得到10,739 bp 的基因序列。通过与其他模式生物 HIF-1α 蛋白功能结构域和基因结构的比较发现，海月水母HIF-1α 具有与高等动 物类似的完整的氧依赖降解调控结构域（NODD 、CODD 和 CTAD ），然而结构 域的组织形式和基因结构却更倾向于低等动物。 2 、在海月水母体内检测到HIF-1α 蛋白的存在并证实该蛋白受环境低氧的诱 导表达 利用重组蛋白的体外表达技术成功获得约为75 kDa 的海月水母HIF-1α 蛋白 片段（融合蛋白），并通过免疫得到针对该蛋白片段的高效价特异性多克隆抗体。 利用纯化的多克隆抗体，通过免疫印迹技术在海月水母体内检测到HIF-1α 蛋白 的存在并证实该蛋白受环境低氧的诱导表达。 3、确定了用于低氧相关基因表达分析的内参基因 通过对刺胞动物门肌动蛋白（actin ）保守序列的分析，设计并合成其 actin II 万方数据 基因的简并引物。以海月水母cDNA 为模板，通过克隆测序获得849 bp 的β -actin 基因的部分 cDNA 序列。利用实时荧光定量 PCR 技术对海月水母 18S rRNA、 β -actin 、α-tubulin 和GAPDH 四个候选基因在正常（对照组）和低氧条件下的表 达量进行检测，通过内参基因筛选软件对它们进行分析筛选，最终确定α-tubulin 基因作为海月水母耐受低氧分子机制研究的内参基因。以此为基础，建立了低氧 耐受过程相关基因相对表达量分析的实时荧光定量PCR 检测方法（RFQ-PCR ）。 4 、研究了海月水母在低氧环境条件下的生理活性（伞部搏动）、脯氨酸羟基 化酶-低氧诱导因子氧感受体系相关基因（PHD 和HIF-1α ）、能量代谢相关基因 （ALDO 、LDH 和PDK ）和HSP70 基因的表达以及能量代谢产物（乳酸）含量 随时间的变化规律，发现： （