2011-07：第七章 营养代谢病检测技术(2h).ppt

染色：通电完毕，镊子取出，浸于氨基黑的染色液中5分钟，立即放入盛有漂洗液的培养皿中，反复漂洗数次，直至背景漂净，滤纸吸干，不要太干。 定量： 取6支试管，编号，分别用吸管吸取0.4N NaOH 4ml； 剪下膜上各蛋白质带及另一空白部位剪一平均大小的薄膜条（空白带的宽度以最窄的条带为准）。将各条分别浸于上述试管内（注意管与蛋白带的顺序），用力摇动，使蓝色洗出，约半小时； 用分光光度计进行比色，波长650nm，以空白薄膜条洗出液为空白对照，读取A、α1、α2、β、γ球蛋白各管的光密度。 结果计算： 光密度总和 T ＝ A+α1+α2+β+γ 白蛋白％＝A/T×100% α1球蛋白％＝ α1/T ×100% α2球蛋白％＝ α2/T ×100% β球蛋白％＝ β/T ×100% γ球蛋白％＝ γ/T ×100% 四、血红蛋白测定（沙利氏比色法） 试剂 转化液：氰化钾50mg，高铁氰化钾200mg，无水磷酸二氢钠114mg， Triton X-100 1.0ml，蒸镏水1000ml。溶解混勾后用滤纸过滤，置棕色瓶中，保存于冷暗处，但勿使结冰，可保存数月。 该液应透明、淡黄色，pH7.0?7.4，以蒸馏水作空白，在540nm处比色，吸光度应小于0.001。 若浑浊、变绿则应废弃。 四、血红蛋白测定（沙利氏比色法） 操作 取血20μl加5ml血红蛋白转化液，充分混匀，静置5min。 用波长540nm，光径1cm，转化液或水作空白，测吸光度 计算 血红蛋白（g/L) =测定管吸光度× (64458 ÷ 44000) ×251 式中：64458血红蛋白平均分子量，44000血红蛋白摩尔吸光度，251为稀释倍数。 因品种、年齢和环境血红蛋白有差异，参考值90~120g/L 四、血红蛋白测定（沙利氏比色法） 附注 血液用EDTA二钠抗凝，不可用肝素钠抗凝。 氰化钾为剧毒化学品，在配置和保存过程中应注意安全。 测定废液应加次氯酸钠〔35ml/L) 混匀敞开过夜，使氰离子氧化成CO2和N2挥发后，再排入下水道中。 四、血红蛋白测定（沙利氏比色法） 临床意义 血红蛋白占红细胞32%~36%，或干重96%。在某些类型贫血时（如低色素贫血）红细胞与血红蛋白降低程度不一致，血红蛋白降低比红细胞明显。同时测定红细胞数与血红蛋白，对诊断有实际意义。 血红蛋白增多：如血浆中水分丢失；红细胞增生活跃。 血红蛋白减少：贫血性疾病；其中营养性贫血见于蛋白质缺乏，铜、铁、钴等微量元素缺乏， 维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、叶酸、烟酸缺乏等。 五、肌红蛋白测定 肌红蛋白（Mb） ：横紋肌色素成分，分子量170 kD。肌细胞内贮存和运输氧。肌肉组织损伤时Mb从肌细胞中释放入血，血清Mb升高，大部分以游离状态存在，小部分与血清蛋白结合；肌红蛋白血症和肌红蛋白尿。 测定方法：溶解度试验、比色法、放射免疫法、酶联免疫法、胶乳凝集试验、荧光免疫法、滴金免疫法等。 五、肌红蛋白测定 1、Mb溶解度试验 原理 Mb分子含血红素基团，有氧化酶活性，用联苯胺或邻甲苯胺同过氧化氢反应呈色鉴定，Mb可溶解于80%饱和度的硫酸胺溶液，而Hb则不能。 试剂 1%邻甲苯胺甲醇溶液：难溶解但较稳定。 过氧化氢醋酸溶液：冰醋酸1 + 3%过氧化氢2。 硫酸胺（化学纯） 五、肌红蛋白测定 操作 先检尿液有无血红素存在，新鲜尿液4滴 + 邻甲苯胺液2滴，混合，+过氧化氢醋酸溶液3滴，有蓝色或蓝绿色。 取过滤后透明尿液5ml + 硫酸胺2.8g，溶解混勾，静置5 min，滤纸过滤。 取滤液重复测试有无血红素色素存在，阳性表示含Mb。阴性表示色素是Hb。 五、肌红蛋白测定 2、反向胶乳凝集法 原理 Mb与用Mb单克隆抗体致敏的羧化聚苯乙烯胶乳作用出现凝集者为阳性。 试剂 羧化聚苯乙烯粒子； pH 8.4， 0.1mol/L硼酸-甘氨酸缓冲液； Mb单克隆抗体； 牛血清白蛋白。 五、肌红蛋白测定 操作 用Mb单克隆抗体致敏羧化聚苯乙烯胶乳。取250μl硼酸-甘氨酸缓冲液混合，逐滴加1%羧化聚苯乙烯粒子500μl，边加边摇动试管混匀，加入1mg牛血清白蛋白置37℃水洗30min，用硼酸-甘氨酸缓冲液洗两次后，放4℃冰箱保存。 取待检血清10μl，用pH 8.4硼酸-甘氨酸缓冲液做1：20倍稀释，取25μl与等量致敏胶乳在玻片上混合摇动， 观察3min，同时做阳性和阴性对照。 五、肌红蛋白测定 结果判断 4+：全部呈粗粒状凝集，边缘有厚凝集圈，中间液体清亮 3+：大部凝集，周围有凝集，中间液体微浑浊。 2+：中度凝集，颗粒较细，凝集圈不显，液体浑浊。 +：少量凝集，液体明显浑浊。 -：保持均匀的乳