《HBV核心蛋白突变体L60 V重组质粒的构建及其应用于IFN-α抗病毒机制.》.pdf

安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2014Feb；49(2) ·181· HBV核心蛋白突变体 L60V重组质粒的构建 及其应用于 IFN．0抗【病毒机制 孙蓓蓓，管世鹤，王爱华，杨 凯，潘 颖，吴园园 摘要 目的 构建乙型肝炎病毒核心蛋 白(HBc)突变体 白(HBc)，由于宿主免疫攻击 ，C区易发生突变，来 L60V重组质粒 ，并探讨 L60V拮抗d干扰素(IFN一)抗病毒 逃避宿主免疫清除病毒的作用 J。我国HBV患者 活性的机制。方法 构建HBc突变体融合表达载体pEGFP— 中最常见是 L60V (CTG—GTG)点突变。 目前，仅一干 L60V，转染 人肝胚瘤 细胞株 HepG2细胞，荧光显微 镜及 扰素(IFN—)是治疗 HBV最常用有效的药物，主要 Westernblot法检测其在细胞 中的表达；并 以RT—PCR及 通过诱导合成多种抗病毒蛋 白如抗黏液病毒 A Westernblot法检测JAK—STAT信号转导途径分子及抗病毒 (MxA)蛋 白、2，5寡腺苷酸合成酶(2，5一OAS)、蛋 蛋白表达。结果 经酶切和测序分析，成功构建 HBc突变 白激酶 (PKR)等来发挥抗病毒作用 。然而，临床 体L60V重组质粒；将 L60V和 HBc野生株表达质粒 (pEG— FP—wT)分别转染 HepG2细胞后，以 1000IU／mlIFN一 处 上约有 1／3的患者对 IFN— 发生持续性应答 。有 理，转染 L60V和 HBc野生株表达质粒的细胞 内抗黏液病毒 研究 表 明 HBc可 以拮抗 IFN—o【抗病毒作用，而 A(MxA)及 JAK—STAT信 号转导途径分子 STAT1、STAT2、 L60V突变对 IFN-作用的影响机制尚未明确。该 IRF9表达减少，其 中在转染 pEGFP—L60V细胞 内的MxA、 实验构建重组质粒 pEGFP-L60V，以HepG2细胞为 STAT1、STAT2和 IRF9表达显著减少。结论 HBc突变体 研究模型，通过RT—PCR及Westernblot法检测 IFN— L60V町能通过 JAK—STAT信号转导途径抑制抗病毒蛋白 OL抗病毒蛋 白、JAK-STAT信号转导途径分子的mR— MxA的表达来拮抗 IFN—Ot的抗病毒作用；其拈抗 IFN—d抗病 NA及蛋 白水平，探讨pEGFP—L60V对 IFN一仅抗病毒 毒作用比HBc更显著。 作用的影响。 关键词 乙型H十炎病毒；核心蛋 白；HepG2细胞；IFN—Ot 中图分类号 R512．62 1 材料与方法 文献标志码 A 文章编号 1000—1492(2014)02—0181—05 1．1 材料 慢性乙型肝炎是严重威胁生命的全球性疾病 ， 1．1．1 质粒、菌株及细胞系 质粒HBVdimer是含 影响着世界范围内3500多万人 。乙型肝炎病毒 头尾相连的HBV令基因组的双拷贝基因，为本实验 (hepatitisBvirus，HBV)c区基因合成 HBV核心蛋 室保存；空载体 pEGFP—N1和E．coli菌株 DH5a为 本室保存；pMD18-T载体购 白TaKaRa公司；人肝胚 20l3—08—08接收 瘤细胞株HepG2为本