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（二）有机溶剂沉淀蛋白质 与水互溶的极性有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。 有机溶剂引起蛋白质变性的原因有两个： 降低水的介电常数，使蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，促进了蛋白质分子的聚集沉淀。 是极性有机溶剂与蛋白质争夺水化水，而使蛋白质分子沉淀。 不同的蛋白质由于水化层厚度不同，发生沉淀需要的有机溶剂浓度不同，因此可利用不同浓度的有机溶剂分离不同的蛋白质。 室温下，有机溶剂不仅能使蛋白质沉淀，而且伴随着变性。 若预先将有机溶剂冷却，然后在不断搅拌下将其逐渐加入蛋白质溶液中，防止有机溶剂局部浓度过高，则在很大程度上解决变性问题。 （五）等电点沉淀 蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净电荷数量有关，随溶液pH变化而变化。在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小。 不同的蛋白质有不同的等电点，因此通过调节溶液pH到目的蛋白的等电点，可使之沉淀而与其它蛋白质分开，从而除去大量杂蛋白。 * * 第四章 分离纯化常用技术、原理及方法 生物大分子分离与表征 shaoyunwang@ 沉淀法 一、沉淀法分离蛋白质 二、沉淀法分离核酸 一、沉淀法分离蛋白质 最经典方法之一。 根据物质的结构差异性（如蛋白质分子表面疏水基团和亲水基团间的差异）来改变溶液的性质，（如pH、极性、离子强度、金属离子等），导致目的蛋白质的溶解度发生变化。 ---或蛋白质沉淀 ---或杂质沉淀 操作简单 成本低 在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称为盐析。 （一）盐析 1. salting in – proteins are less soluble at very low salt concentrations (ionic strength); salt ions helps shield proteins multiple charged groups. 2. salting out – proteins are also less soluble at salt concentrations (high ionic strength) because the salt ions bind most of the water molecules 3. These two effects are different for different proteins == fractionate by raising the [salt] just below point where protein to be purified becomes insoluble, removed other precipitated proteins by centrifugation, then raise the [salt] to precipitate protein and collect it by centrifugation. 常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。 盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性。 分段盐析 半饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆球蛋白，而饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆清蛋白。 一般选择0－25％饱和度硫酸铵使部分杂质盐析，25－90％饱和度硫酸铵使目标蛋白盐析 脱盐: desalting process dialysis 凝胶过滤法 透析袋透析：透析袋选择和处理； 适当的透析液； 合理透析时间。 透析示意图 Simple figures to dialysis 凡能与水以任意比例混合的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀蛋白质。 沉淀原理： ① 脱水作用； ② 使水的介电常数降低，蛋白质溶解度降低。 有机溶剂沉淀注意点 （三）蛋白质沉淀剂 蛋白质沉淀剂仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用，专一性强。 1、碱性蛋白质：如鱼精蛋白－磷酸果胶激 酶； 2、凝集素：如植物血球凝集素－糖蛋白； 3、重金属：如铅盐、汞盐，注意透析。 （四）聚乙二醇沉淀 －分子量400－6000； －条件温和，不引起蛋白质变性； －受pH、离子强度、蛋白质浓度等因素影响。