2012级硕士研究生“微生物工程”考试要点.docVIP

1、工业菌种改良的方法有哪些？ (1)解除或绕过代谢途径中的限速步骤：通过增加特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达能力来提高限速酶的含量；在代谢途径中引伸出新的代谢步骤，由此提供一个旁路代谢途径。 (2)增加前体物的浓度。(3)改变代谢途径，减少无用副产品的生成以及提高菌种对高浓度的有潜在毒性的底物、前体或产品的耐受力。(4)抑制或消除产品分解酶。 (5)改进菌种外泌产品的能力。(6)消除代谢产品的反馈抑制。如诱导代谢产品的结构类似物抗性。 2、基因克隆的最后一步是从转化细菌菌落中筛选出含有阳性重组子的菌落，并鉴定重组子的正确性，有哪些方法，其原理是什么？ 一、抗药性标志的筛选：如果克隆载体带有某种抗药性标志基因如ampr或tetrr ，转化后只有含这种抗药基因的转化子细菌才能在含该抗菌素的平板上幸存并形成菌落，这样就可将转化菌与非转化菌区别开来。如果重组DNA时将外源基因插入标志基因内，该标志基因失活，通过有无抗菌素培养基对比培养，还可区分单纯载体或重组载体（含外源基因）的转化菌落。 二、β－半乳糖苷酶系统筛选：很多载体都携带一段细菌的lacZ基因，它编码β－半乳糖苷酶N-端的146个氨基酸，称为α－肽，它表达β－半乳糖苷酶的C-端肽链。当宿主的细胞的β－半乳糖苷酶基因发生删除突变，缺失N－端的一段氨基酸序列，使酶失活，但在α－肽存在时可以互补使酶恢复活性。携带pUC质粒载体的大大肠杆菌在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropylthio-β-D-半乳糖苷,ITPG）的诱导下发生α－互补，可使呈色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷被分解产生蓝色。而重组子由于基因插入使α－肽基因失活，不能形成α－互补，在含X-gal（5-溴-4-氯－3－吲哚-β-D-半乳糖苷）的平板上，含阳性重组子的细菌为无色菌落或噬菌斑。 三、菌落快速裂解鉴定法：从平板上直接挑选菌落裂解后，直接电泳检测载体质粒大小，判断有无插入片段存在，该法适于插入片段较大的重组子初筛。 四、内切酶图谱鉴定：经初筛鉴定有重组子的菌落，小量培养后，再分离出重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的内切酶切割，释放出插入片断；对于可能存在双向插入的重组子，还要用内切酶消化鉴定插入的方向。 五、重组DNA的鉴定 3、什么是微生物的生物转化？有什么特点？简述微生物转化的一般过程？ 微生物的生物转化反应定义：是利用生物细胞对一些化合物某一特定部位（基团）的作用,使它转变成结构相类似但具有更在经济价值的化合物.最终产物是由微生物细胞的酶或酶系对底物某一特定部位进行化学反应而形成的。 微生物的生物转化特点：1、生物转化具有化学变化的单元反应多类型。由于微生物转化对甾体激素药物工业所起的重大作用，因此人们对微生物生物转化反应的研究与其他化合物的微生物转化来比较，是研究得最为深人广泛的.微生物几乎对甾休的每个位置都能进行转化，涉及的反应类型也最为广泛；2微生物的生物转化起着立体专一性催化剂的作用.不同的化学变化单元反应类型，发生在化合物分子的不同位置。反应可在分子中通常因活性不足而不能用化学方祛生反应的位置进行。反应通常是含有几种酶的一种微生物来完成的。3.微生物的生物转化产物产率高。 微生物转化的一般过程：1、制备培养系统：选择优良的培养物，使其生活在合适的环境中，达到足够的菌体，这些菌体是生物转化反应的催化剂。2、加入底物：底物加入的时间与方法是重要的考虑因素。3、加入效应物：效应物是反应后未改变的化合物。效应物分抑制剂或激活剂。加入抑制剂，可以有效抑制副反应。这些化合物加入的时间和方法也十分重要。4、保温反应：在合适的环境条件下进行保温，直至转化反应完成。5、监测反应过程：间歇取样并监测底物与产物水平、pH、细胞量、能源和其他参数。6、终止反应：当样品分析表明产物积累停止，则移去活性细胞，停止反应。7、产物分离：生物转化的溶剂主要是水，产物在水中浓度相对较低，经过分离和纯化得到产物。 4、分解代谢物阻遏作用与环腺苷酸（cAMP）的浓度有什么关系？ 分解代谢物阻遏作用与环腺苷酸（cAMP）的浓度有关。 ①当存在容易利用的碳源时（如葡萄糖）， cAMP浓度低→ cAMP－CRP复合物不能形成→ cAMP－CRP复合物不与启动基因结合→RNA聚合酶不能结合到启动基因上→无法转录、翻译→不能合成酶；②当容易利用的碳源（如葡萄糖）不存在， cAMP浓度高→ cAMP－CRP复合物能形成→ cAMP－CRP复合物与启动基因结合→RNA聚合酶能结合到启动基因上→进行转录、翻译→进行酶的合成。 5、比较单级萃取、多级错流萃取、多级逆流萃取的优缺点？ 单级萃取:流程简单，效率不高，增加萃取剂的用量会使产品的浓度降低，对萃取剂的处理、回收增加工作量。 多级错流萃取:溶剂分别加入各级萃取器，萃