实验四 酵母分批培养实验.docVIP

实验四 酵母分批培养实验 一、目的 掌握微生物分批培养的生物反应器操作； 掌握的菌体浓度、总糖等参数测定方法； 掌握分批培养的生长动力学及生长曲线的测定方法。 了解酵母的生长特性。 二、原理 分批反应操作是指基质灭菌、接种以后，除了好氧反应需要在反应过程中通入无菌空气、消除泡沫所用的消泡剂以及维持一定pH值所用酸碱之外，反应过程中不再加入反应基质。 基质浓度、产物浓度以及细胞浓度均随反应进行的时间而变化，尤其是菌体本身将经历不同的生长阶段（在培养的过程中，微生物的生长可分为迟缓期、对数生长期、减速期、静止期），显示出不同的催化活力。 基本特征是：反应物料一次加入一次卸出；反应器物系的组成仅随时间而变化，即随着培养的进行，基质的浓度下降，菌体量增加，产物增加。因此它属于一非稳态过程。 三、主要试剂与设备 酵母、培养基、菲林试剂、0.05N NaOH 1mg/ml葡萄糖标准溶液等 100L机械搅拌式反应器、pH计、离心机、分光光度计等 四、步骤 （一）准备工作 1. 发酵罐的组装工作 （1） 连接好冷却水管。若采用自来水冷却，要考虑到白天与夜间水压的变化，尽可能采用耐压管，连接部要充分牢固，并且注意连接管管径与自来水管管径应一致。 （2）由于通人的空气有一定压力，应注意连接压缩空气的管子应能承受一定压力。 （3）安装pH及溶解氧等检测装置，注意各接线口不要出现差错。由于操作过程要和水打交道，故线路连接一定要注意安全，要特别注意防止漏电。 2. 种子培养 液体试管培养：自斜面菌种挑取一环酵母菌体，接入装有10ml 10-12oBx无菌麦芽汁的液体试管中。摇匀，置于30℃培养箱24h. 三角瓶装培养：将上述培养好的液体试管种子接入250m1三角瓶的灭过菌的100 10-12oBx的麦芽汁，接种量10%， 30℃培养箱15-20h. 3. 培养基的配置：按配方配置发酵罐。培养基的体积通常为罐容积的50-60%。准确称量培养基各组分，溶解。一般配置培养基的体积为预定的70%，因为灭菌时，通入的蒸汽发生冷凝，会使发酵液的体积增加。使用合成培养基时，将糖类及磷酸盐溶液分别用高压灭菌锅灭菌，开始培养前放入发酵罐内，这是为了避免灭菌时糖类物质与氨基化合物反应生成褐色物质，以及防止磷酸盐与其它金属离子生成沉淀。 4. 发酵装置(罐)的清洗 发酵罐使用前后都应认真清洗，特别是前后两次培养采用不同的菌株时，更应注意清洗和杀菌工作。 发酵罐有多种型式，罐内(可进行清洗的)任何部分都应认真清洗，否则都可能成为杂菌的滋生地。一般认为，发酵前期引起杂染菌的主要原因是由于清洗不净。易被忽略而未能充分清洗的地方有喷嘴内部与取样管内以及罐顶等处。另外，还应充分注意发酵罐周围的附件设备，如加热器、电机等的安全使用。 5. 电极的标定 对pH电极和溶氧电极进行零点校正和斜率校正。 6. 参数的控制及设定 根据发酵要求在操作面板或反应器应用程序上进行设定。 发酵控制参数值如下： 温度30℃ 时间48h, 空气流量 —— 转速 80-100r/min （三）发酵罐发酵 步骤如下： 清洗→空消→实消→冷却→接种→发酵→取样→放罐 1. 蒸汽的产生 打开蒸汽发生器进水阀和放气阀，加水至水位上限，关闭进水阀和放气阀。 启动蒸汽发生器电源开关加热至0.40MPa左右。 2. 空消 空气过滤系统只空消，不实消，以免实消罐中物料冲入过滤器内； 通蒸汽前检反应器所有阀门是否关闭。 打开蒸汽发生器排冷凝水的阀门，排放冷凝水至蒸汽出现，关闭此阀门；然后打开蒸汽发生器供给反应器蒸汽的阀门。 进蒸汽顺着蒸汽管路开阀门，蒸汽为活汽。打开罐顶排气，先对空气过滤系统灭菌，顺着气路开阀，再开尾阀排冷凝水，排掉冷空气，待有蒸汽冲出后调小，打开主阀，保证有活蒸汽放出，但不能太大，以免分压；再进罐体，蒸汽分三路进罐，先主管道，后次管道；蒸汽也按以上规则顺行进路径开阀，先开支路阀，再开排汽阀，最后为进罐阀。 罐压升至0.12MPa(此时控制系统中温度读数约为120℃左右)时开始计时，灭菌30min。灭菌时，保持各阀排气通畅，防止存在死角。保压方式：a. 调节主汽路进汽阀门控制进汽量；b. 调节空气排气口阀门大小或出汽阀大小。 灭菌结束时，逆着进路关阀门。空气过滤系统先关主阀后关尾阀，完成；进罐蒸汽管路先关进汽阀，再排汽阀，最后为支路阀。但空消一结束，即要通入无菌空气吹干空气过滤系统管路并保压，避免染菌。 打开罐顶排汽阀直至表压为零，再通过罐底排空罐里的冷凝水。 注：粗过滤器不空消也不