赤点石斑鱼重组激活基因1和相关免疫因子的克隆分析及发育早期免疫机制研究.pdf

摘要 摘要 akaara)经济价值高，是一种重要的海水养殖鱼类。 赤点石斑鱼(Epinephelus 目前，赤点石斑鱼仔稚鱼期死亡率高，而且受到神经坏死病毒的感染严重，人工 增养殖一直受到制约；另一方面，赤点石斑鱼基础免疫学理论尚属空白。为了阐 明赤点石斑鱼免疫系统随个体发育变化的特点，本研究运用分子生物学技术，从 特异免疫和非特异免疫系统两个层面出发，对几个主要的免疫学相关因子进行深 入研究和探讨，并初步阐明了赤点石斑鱼免疫系统早期发育的特点。主要研究成 果如下： 1．克隆获得了赤点石斑鱼重组激活基因RAGI的cDNA序列。运用RACE 软件拼接，获得赤点石斑鱼RAGl基因的cDNA序列，其开放阅读框为2778 bp的 序列，3’非编码区包含多腺苷酸加尾信号序列(AATAA)，位于poly(A)上游的 酸序列结构特点与高等哺乳动物相似，也是由非核心区和核心区组成，并且发现 核心区相对较保守，在鱼类中相似性高达90％以上。非核心区含有一个锌指二聚 体结构域ZDD(氨基酸序列为142．270)；核心区包括中心区和C端区，中心区包 了ZDD和NBR的三维结构模型，对深入研究鱼类免疫机制具有重要意义。 2．揭示了RAGl基因在幼鱼和成鱼各组织中的表达特性。本研究首次克隆获 得了赤点石斑鱼13-actin的ORF，并以此为内部参照物，建立了荧光定量PCR方法。 实验结果发现，RAGI基因的转录发生在胸腺和头肾组织中，并且胸腺中的RAGl mRNA水平明显高于头肾组织。与4月龄幼鱼相比，18个月龄赤点石斑鱼肾脏和 胸腺中的RAGlmRNA水平显著降低。免疫印迹和免疫组织化学法的实验结果进 一步验证了RAGl在蛋白水平上的表达。 3．克隆获得了分泌型免疫球蛋白IgM重链基因的cDNA序列，并揭示了IgM 基因mRNA在赤点石斑鱼各组织分布特点。通过RACE PCR获得了IgM重链 摘要 371 bp，3’端非编码区15lbp。3’端包括一个加尾信号 bp，开放阅读框1737 个氨基酸残基构成，Genebank序列号为AEK82140，预测分子量为65kDa。序 列比对显示，该IgM序列与其他已报道的IgM序列具有高度同源性，包括一个 推测该IgM属于分泌型，并成功构建了赤点石斑鱼IgM重链的三维结构。荧光 实时定量PCR法对IgM的相对定量结果显示，除了性腺之外，在脑、肝脏、肾 脏、脾脏、心脏、鳃、肌肉、胸腺、肠道中均检测到了IgM重链mRNA的表达。 与4月龄相比，18个月龄鱼的肝脏、肾脏、脾脏、心脏、鳃、胸腺中lgM重链 中无显著变化。 4．克隆获得了抗病毒蛋白Mx基因，并揭示了Mx基因mRNA在赤点石斑 鱼各组织的分布特点。Mx基因的cDNA序列全长为2200 bp，包括一个开放阅 读框1848 bp和3’端非编码区352bp。其中3’端非编码区 bp，5’端非编码区68 含有一个AATAA加尾信号和一个多聚A尾巴结构。根据ORF框推导的氨基酸 序列包括616个氨基酸残基，分子质量约69．76kDa，理论等电点为5．32。序列 比对发现，该氨基酸序列在石首鱼中同源性高达80％以上，属于动力蛋白家族成 员之一，具有保守的GTP酶结构特征。利用荧光实时定量PCR法对4月龄和18 月龄赤点石斑鱼各组织中的Mx转录水平进行研究显示，除了性腺之外，脑、肝 脏、肾脏、脾脏、心脏、鳃、肌肉、胸腺、肠道中均检测到了MxmRNA的存在， 其中鳃组织中Mx的表达量最高。与4月龄幼鱼相比，Mx在18月龄鱼的脑、头 肾、和心脏中显著下调表达(PO．05)，但在脾脏中显著上调表达(P0．001)， 肌肉、肠道、胸腺、肝脏和鳃中无显著变化。 mRNA在赤点石斑鱼各组织中的分布特点。根据一对特异引物经PCR扩增在赤 点石斑鱼中获得了一种抗菌肽cDNA序列，全长330