如何用API LC-MSMS检测硝基呋喃代谢物.PPTVIP

如何用API LC-MS/MS检测硝基呋喃类代谢物 李立军 AMOZ AMOZ-D5 AOZ AHD AHD内标（选252/134 ） SEM内标（选212/195） API3000 SEM结果1 SEM线性 某台API3000最低检出限优于0.1ug/kg 某台API3000最低定量限优于0.25ug/kg LC梯度之一 API4000 LC/MS/MS 条件 API3000 LC/MS/MS 条件之一 * 第一步：配制衍生化后的硝基呋喃代谢物标准溶液，乙腈/水体系，浓度10PPM 确认仪器已经校准，气体、电压工作正常。 测试条件： 离子化方式: ESI+ 在TUNE栏内SYRINGE PUMP进样，5ul/min， Q1 SCAN 观察M/Z 335，236，249，209及同位素内标峰，通过调节DP，使这几个峰最强，平均后确认小数点后数值，准确到0.1，例如249.1 。 注意：1如买来的是已经衍生化的标准品，则可四种混配。 2如是用户由硝基呋喃代谢物衍生化的，最好四种分 别配制，要求Q1 SCAN能明显观察到上述 离子。下图是一个用户的混标，只看到335和209。 第二步：以第一步测得值为母离子，做PRODUCT ION SCAN（MS2），调节CE等参数，使母，子离子都具有一定强度，平滑后得到MS2谱，从各母离子中各选择2个最高的子离子，分别为呋喃它酮AMOZ： M/Z 291，262；呋喃唑酮AOZ： M/Z 134，104；呋喃妥因AHD： M/Z 134，104或178；呋喃西林SEM： M/Z 192，166，准确到0.1。注意：母离子要采用Q1SCAN测得值，子离子采用PRODUCT ION SCAN测得值。典型MS2谱图如下，如子离子与之不符合，则可能是标准品有问题。 第三步：以第二步选定的离子对，例如335.1/262.2 等，做MRM SCAN ，TIME值各为50-200ms，强的离子对可短些，弱的可长些。通过EDIT RAMP优化COMPOUND项下面的各参数,如DP,CE等,及手动优化SOURCE/GAS项下面的CAD值，然后SAVE为一个新的方法，例如nf.dam。 第四步：在ACQUIRE栏内打开nf.dam，点鼠标右键ADD DEVICE，加上HPLC PUMP及AUTOSAMPLER，同步方式设为LC SYNC，并编辑设定流动相流速为250 ul/min，乙腈/水=30/70+0.1%色谱纯甲酸，采样时间设为0 .6-0 . 8 min， AUTOSAMPLER进样2 ul，MS EDIT PARAMETERS将TEMP设为400度， CUR， NEB GAS都相应增大。然后再SAVE此方法。将PEEK管不连色谱柱，从AUTOSAMPLER直接连到离子源，调节喷雾针的位置，比直接进样距ORIFACE远2-3mm，打开辅助气，点击平衡图标，调出此方法，平衡5min。将样品稀释为10ppb，放入样品架。 注意：流动相流速根据要选用的色谱柱内径而定。 第五步：在TUNE栏内点击QUANTITATIVE OPTIMIZATION定量优化，只需优化SOURCE/GAS项参数，具体方法参见V. Automatic Quantitative Optimization of Ion Sources by FIA教程 第六步：接好色谱柱，关掉TUNE，在ACQUIRE栏下调出上一步优化好的方法，改变采样时间为20min，编辑LC梯度洗脱，SAVE，平衡20min，然后进样，观察色谱峰形及保留时间是否合适，否则调节流动相，优化色谱条件。 注意：梯度洗脱后进下一针样品时一定要充分平衡。 第七步：用空白提取液配制同样浓度标样，按上一步方法进样，观察色谱峰形及保留时间是否合适，峰高有无变化，有无离子抑制现象，否则调节流动相，优化色谱条件。 第八步：用空白提取液配制一系列不同浓度硝基呋喃代谢物标样，按上一步方法进样，例如，分别稀释为浓度0.25ug/kg, 0.5ug/kg, 1.0ug/kg, 2.0ug/kg, 4.0ug/kg, 8.0ug/kg, 等等。 第九步：按上述方法采集数据，做标准曲线,并进行硝基呋喃代谢物样品的测定。打开QUANTITATION WIZARD，按照教程VII. Quantitate Processing LAB 进行计算。 如果4种同位素内标齐全，则定量时一一对应计算，如只有AOZ-D4和AMOZ-D5，则1种内标可对应2种硝基呋喃代谢物。 下面是一些事例： 硝基呋喃样品提取衍生和净化方法之一 1．??????提取：称取经肉类组织粉碎机粉碎的试样2g（精确至0.05g）于50mL心管中，加入100uL内标混合溶液，