H3N2亚型猪流感病毒进化分析及其重组HA1蛋白间接ELISA诊断方法的建立.pdfVIP

摘 要 H3N2弧型猪流感病毒在全世界猪群中广泛存在，不仅给养猪业带来了巨大的经济损 失，而且对人类健康造成威胁。为了了解我国2004～2005年猪流感病毒流行情况，我们对 中国某些省市猪群进行猪流感血清学和病原调查研究，从1238份猪鼻棉拭子和猪肺、气管 样品中分离到5株H3N2距弛猪流感病毒。 通过比较发现分离的5株H3N2弧型猪流感病毒HA和NA基因同源性较高，都达到 隆，测序，构建HA、PB2、NP部分基冈片段的系统进化树，从系统进化树来看它属于近期 人流感病毒分支，通过对HAl编码的氨基酸序列和参考毒株进行比较，得知其在某些氨基 酸位点发生了突变． 阳性重组子pMD-HA，以此为模板扩增出HAl片段，去除编码HA信号肽的核苷酸序列， 然后亚克隆到原核表达载体pET30a上，经双酶切、PCR鉴定，筛选重组表达质粒pET-HAl， 型猪流感病毒HAl基因在原核表达系统中已表达，HAl蛋白表达量占细胞总蛋白的40％， 分子量近似42KD。Western．blot检测结果表明表达蛋白具有良好的抗原性。 利用表达并纯化后的重组蛋白作为抗原．建立检测H3弧型猪流感病毒抗体的间接 ELISA．为了优化ELISA反麻条件，我们_HjH3弧型猪流感病毒的标准阳性血清和标准阴性 血清进行反应，最终确定了抗原的最适包被浓度为1．5pg／lOOp