血球计数板计数验.docVIP

环工综合实验 血球计数板计数实验 实验报告 环境科学与工程学院实验中心 实验题目 血球计数板计数实验 实验类别 综合 实 验 室 实 验 时 间 实验环境 温度: 湿度: 同组人数 一、 实验目的 了解血球计数板的结构 掌握利用血球计数板计微生物细菌数的原理和方法 二、 实验仪器及设备 细菌及培养基：斜面 仪器：血球计数板，显微镜。 其它：蒸馏水，盖玻片，载玻片，无菌吸管，10mL、5mL移液管 三、实验原理 实验原理问答题： 1.血球计数板计数原理是什么？如何使用血球计数板对微生物尺寸大小进行测定？ 答：血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有四个槽构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各刻有一小方格网，每个方格网共分九个大方格，中央的一大方格作为计数用，称为计数区。计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个中方格（大方格用三线隔开），而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个中方格（中方格之间用双线分开），而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。 计数区边长为1mm，则计数区的面积为lmm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。 使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。 2.血球计数板计算微生物数量的优缺点是什么？血球计数板与平板稀释法对细菌个数进行测定，结果往往差别很大。分析原因。 答：⑴将细菌（或其他微生物）以染料（例如结晶紫）染色后，直接以显微镜观察的方式计数，再推算回细菌数，所得即为总菌数，即死菌、活菌一并计算。 优点：简单、快速、重复性高。 不足：不能区分死细胞和活细胞，应用范围较窄；一些小的细胞在显微镜下很难看到；样品中菌液浓度不能低于106个/mL；不能用于菌丝体或呈链状而不分散的微生物测定 ⑵血球计数板计量时所得到的结果为死菌与活菌的总数，而平板稀释法培养得到的为活菌数目，因此结果差异较大。 四、实验步骤 1.稀释：取接种酵母菌的斜面一支，加入5ml无菌水，摇晃试管一分钟，使形成菌液；将菌液倒入洁净的150ml锥形瓶中，加结晶紫三滴，摇晃2分钟，再加入无菌水至50ml。 2.镜检计数室：在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗后才能进行计数。 2.加样品：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酿酒酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。 4.显微镜计数：静止5分钟后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜。每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的中格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。 5.清洗血球计数板：使用完毕后，将血球计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。（注意：血球计数板计数室只能水冲，不得擦拭！） 五、实验数据及观察结果 血球计数板镜检结果： 稀释倍数：5mL→50mL，10倍 5个中格内分别有10、10、5、7、9个菌体 六、数据处理及结论 N=10＋10＋5＋7＋9=41 稀释倍数：10 酵母菌浓度=N×25/5×10×106×稀释倍数=41×25/5×10×106×10 =2.05×1010cfu/L 七、思考题 1.有人想通过测量菌液浊度来计算细菌数量。他的想法可行吗？试分析。 答：可行。使用细菌浊度计测量菌株悬液中细菌浓度，菌液的浓度可用麦克法伦特氏标准比浊法来测定：配制1%硫酸溶液及1%氯化钡溶液，按梯度配置混悬液，得到一系列标准比浊管，将洗下的细菌原液放入与比浊管相同的试管中并予以一定稀释。与标准比浊管相比较，视其浊度相当于比浊管的第几管，然后将比浊管相当菌数乘以稀释倍数即可得到每毫升中所含细菌的数量。 2.微生物学在环境工程学科的作用如何？请描述。（广泛、详细，不少于500字，并举例说明环境工程中微生物的应用） 答：随着人们生活水平的提高，大家对生活环境的要求也日益严格，环境工程在各领域