猪ZP4B细胞表位人源化定点突变及在大肠杆菌中的表达和鉴定.pdfVIP

中文摘要 猪ZP4B细胞表位人源化定点突变及其在大肠杆菌中 的表达与鉴定 (卵透明带(zona pelluicda，ZP)在哺乳动物的受精过程中起关键 作用，具体表现在诱发精子顶体反应；促进精子与ZP粘附；使精于能 穿透ZP进入卵母细胞：阻止多精子及异种精子受精。因此，卵透明 带成为受关注的免疫避孕疫苗候选抗原。 随着分子生物学技术的发展，以卵透明带为靶抗原的疫苗制备已 从最初的卵透明带及其组分水平向更高层次发展。目前人们已经成功 制备了以卵透明带B细胞表位与外源性T细胞表位组成的嵌合抗原。 以此抗原作为疫苗免疫动物可在生育能力下降的同时避免了卵巢功 能自身免疫性损伤。故确定卵透明带上B细胞表位的确切位置以成为 当今避孕疫苗制备的前沿问题。沁 日本学者Hasegawa等人用单克隆抗体在猪卵透明带ZP4的 步的体外研究表明，虽然用人工合成的此表位片断与外源性的T细胞 表位所得的多肽免疫小鼠所得抗血清可有效抑制猪精卵结合，但对人 精卵结合抑制效果却甚差。本研究正是以此为切入点，拟为今后制备 新的、具高效抗生育作用的人卵透明带B细胞表位避孕疫苗奠定基 础。 通过BLAST，我们发现此八肽表位与人ZP的相应序列仅相差1 个氨基酸，推测可能是不同来源的抗体生物学活性差异的原因之所 在。借助分子生物学手段，我们将编码猪ZP4的cDNA序列进行定点 突变，使原来编码LDPENLTL八肽表位的序列突变成编码相应人卵 透明带上LDPEKLTL序列，同时保持其他序列不变。以同样方法制 各含此表位移码突变的猪卵透明带无关突变体dpZP4。突变后的 目的序列。将亚克隆在大肠杆菌中表达并优化表达、条件，使目的蛋白 在大肠杆菌中得以高效表达。用抗pZP4抗原表位的单抗与抗zP的 多抗分刖作为第一抗体进行Western blotting。结果发现：抗pZP4抗 1 已表达的蛋白确为具生物活性的目的蛋白。抗pZP4单抗与pZP4结 合力强于与hpZP4的结合力。说明单个氨基酸残基的突变可以改变抗 合t但与前两者结合明显强于后者。说明目的表位是pZP显性表位。 4 此外，pZP4除此表位外尚可能存在其它B细胞表位n ／ 关键词： 卵透明带、B细胞表位、人源化点突变、免疫避孕疫苗、 ) 、 I 』 l 分类号： R392：R169 ABSTRACT ofhumanizedmutationforBcell of zona Cloning point epitopeporcine E 4andits in Coil pellucida expression hasbeen Inrecent new to vaccines contraceptive years，a approachdevelop methodinvolves ofchimeric containing widely pepti