菜用大豆离体再生与遗传转化体系的优化研究硕士论文.doc

湖南农业大学 硕 士 学 位 论 文 菜用大豆离体再生与遗传转化体系的 优化研究 Study on Optimization of Plantlets Regeneration and Genetic Transformation System for Vegetable-type Soybean 钟 灿? 二0一二年四月 摘 要 菜用大豆高效再生体系的优化研究 （意义）以9个菜用大豆品种的胚尖为起始外植体，研究消毒方法、预培养天数、不同6-BA浓度和培养基组合等对不定芽的诱导和伸长的影响，以及IBA浓度对不定芽生根的影响。结果表明：用0.1% HgCl2消毒10 min后配合5%的NaClO消毒5 min，消毒效果最佳，胚尖活力好，且适用于各个品种；预培养时间为2 d，6-BA浓度为3.0 mg·L-1，有利于菜用大豆不定芽的诱导；1.0 mg·L-1 6-BA + 0.1 mg·L-1 NAA培养基组合有利于增加有效不定芽数；0.05 mg·L-1 6-BA + 0.1 mg·L-1 IBA培养基组合有利于不定芽的伸长；交大05-133和K06-82为最佳胚尖离体再生基因型，其分化频率分别为91%和92%，诱导20 d后外植体平均不定芽个数为4.6和4.5个，不定芽平均长度为1.38和1.39 cm。最适合诱导胚尖不定芽生根的培养基是1/2MSB5，生根频率达到97%，且须根系多，根系发达，移栽成活率高达100%，再生植株能正常生长开花结荚。这一体系的建立，为进一步以其为受体系统的遗传转化奠定了基础。 菜用大豆胚尖遗传转化体系的优化研究 （基因工程育种的意义及异黄酮）以高效再生体系中筛选出来的4个品种（品种名称加上）的成熟胚尖作为受体系统，用根癌农杆菌介导双元载体（携带3基因）的进行浸染。研究了影响农杆菌介导菜用大豆转化的诸多因素，建立了一套优化的菜用大豆遗传转化体系。结果表明：用蘸取方式浸染胚尖和在不添加滤纸的共培养培养基（英文CCM）上共培养3 d，并分别在侵染菌液和CCM中添加200 umol·L-1AS，有利于提高转化效率，瞬时表达率，稳定表达率；用300 mg·L-1Tic和100mg·L-1Cef能有效抑制农杆菌；在筛选培养基中添加抗氧化剂二流能显著降低胚尖的褐化率数据；1/2MSB5+KT0.2mg·L-1有利于抗性芽的伸长比对照伸长数据。利用这一优化转化体系获得4个品种的转基因植株，经过GUS染色和PCR 分析证明外源的大豆异黄酮基因FNS已经整合到菜用大豆的基因组中，转化频率为4.29%-18% 。 关键词：菜用大豆；胚尖；离体再生；遗传转化；体系优化 Abstract High frequency plant regeneration of vegetable-type bean To study the effect of sterilization, early-culture days, different concentrations of 6-BA and medium formulations on induction and elongation of adventitious buds ,and different concentration of IBA on rooting induction, embryonic tips from nine vegetable-type soybean were used as the initial explants. The results showed that the optimal sterilization was using 0.1% HgCl2 for 10 min and 5% NaClO for 5 min. The optimal adventitious buds induction formulation was MSB5 base medium with 3.0 mg·L-1 6-BA, and the optimal early-culture days of embryonic tips was 2 d. The combination of 1.0 mg·L-1 6-BA and 0.1 mg·L-1 NAA benefited to produce many adventitious buds. The combination of 0.05 mg·L-1 6-BA and 0.1 mg·L-1 IBA benefited to the elongation of adventitious buds. Among the four varieties , the embryonic tips from