虾夷扇贝脓胞病病原查氏弧菌的PCR快速检测.pdfVIP

第 33卷第 10期 水 产 科 学 Vo【．33No．10 2014年 l0月 FISHERIES SCIENCE Oct．20l4 虾夷扇贝脓胞病病原查氏弧菌的PCR快速检测 滕炜呜，李文姬，张 明，李石磊，刘项峰，付成东，刘忠颖 (辽宁省海洋水产科学研究院，辽宁省应用海洋生物技术开放实验室 ， 辽宁省水产分子生物学重点实验室 辽宁 大连 116023) 摘 要 ：应用 PCR技术 ，建立一种能够快速有效检测 出虾夷扇贝脓胞病致病病原查 氏弧菌的方法。根 据查 氏弧菌的GyrB基因的高保守区序列，设计 1对扩增片段为 144bp的引物 ，并利用 PCR技术对其 进行了特异性和敏感性检测 。试验结果表 明，该方法对查 氏弧菌 DNA的检测呈特异性，每个 PCR反 应检测的敏感度为 0．43Pg的DNA和 3．9cur的细菌 。由人工感染和海 区取样 的虾夷扇贝的病灶组 织中可以检测出相应的病原菌，说明本方法有效可行。 关键词 ：虾夷扇贝；脓胞病 ；查 氏弧菌；PCR；快速检测 中图分类号 ：$944．4 文献标识码 ：A 文章编号 ：1003-1ll1(2014)10-0649—05 近年来，随着高密度海水养殖模式 的蓬勃发 长；细菌 自动鉴定系统不仅需要仪器设备，能鉴定 展 ，养殖生物的细菌性疾病发生频率和范 围也在逐 的细菌种类又较少 ；免疫荧光抗体技术需要 比较 昂 渐增大 。其 中弧菌属细菌所引起 的疾病 占有极大 贵的仪器设备 ；酶联 免疫需要制备特异 的抗血清； 的比重 。查 氏弧菌 (Vibtiochagasii)引起 的虾夷扇 16SrRNA特异性不高；核酸探针检测技术 以及交 贝(Pn 0p8c抬7zyessoensis)贝柱脓胞病是近年来 叉结合方法是近年来研究 比较热的方法 ，但操作难 对虾夷扇贝危害较为严重 的一种细菌性疾病 [1]，其 度较大 ；而 PCR检测灵敏度高，操作简便 ，结果直 症状表现为贝壳边缘 内侧常常伴有褐色沉积 ，闭壳 观 ，在快速检测技术中有其独特优势_1。目前副溶 肌收缩无力 ，其上有明显的脓胞病变。这是一种病 血弧菌(V。口r口^nPo cs)rl、哈维氏弧菌(． 程短、范围广、死亡率高的疾病 ，集 中爆发在 7～1O harveyi)n引、溶藻弧菌 (．alginolyticus)L1、灿烂 月份 。2009年大连市长海县西北海域爆发的虾夷 弧菌(．splendidus)E¨]等致病菌的PCR检测方法 扇贝大规模死亡现象就是 由该流行性疾病引起 ，造 已经广泛建立起来 ，近年来更是有多重 PCR检测技 成了巨大的经济损失 。查 氏弧菌引起 的虾夷扇 贝 术 [1¨建立发展起来。笔者通过 PCR检测技术 ， 脓胞病一旦爆发很难得到有效抑制n]，因此建立一 针对 GyrB的高度保守 区设计特异性引物，建立了 种能够快速 、简便 、灵敏的检测技术 ，以便更好地预 一 种快速、特异 、敏感的查氏弧菌的PCR检测方法 ， 测和预防这种现象的发生显得尤为重要。 以期能为虾夷扇贝养殖疾病的预警和预防提供技 目前 ，应用于病原性海洋细菌 的检测技术主要 术支持。 有以下几种 ：传统生理生化方法 (生化管、细菌 自动 1 材料与方法 鉴定系统等)；免疫学检测技术 (免疫荧光抗体技 术[2]、酶联免疫检测 ELISA[3]、斑点酶联免疫 Dot— 1．1 材料 ELISAE4]、 Western印记法 [5]等)；核酸检测技术 (核酸 1．1．1 菌株 探针技术[6]、PCR技术、RAPD