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第三章 基因工程常规技术（P 32—52） 电泳技术 杂交技术 转化技术 PCR 扩增技术 文库构建技术 测序技术 第一节 凝胶电泳技术 电 泳（electrophoresis) 带电物质在电场中向相反电极移动的现象 1、原　理 DNA分子的磷酸基团在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下DNA分子向正极泳动 琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用琼脂糖的分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。 2、琼脂糖凝胶电泳的影响因素 1）样品DNA分子大小和分子构型 2）琼脂糖浓度 p33 取决于所分离DNA片段的大小 3）缓冲液 TAE、TBE 4）电泳条件 电压：3-5V/cm 时间：30-60min 二、聚丙烯酰胺凝胶电泳 以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，其分辨率高于琼脂糖凝胶电泳，用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。分离小片段DNA(1—1000bp)效果较好,其分辩力极高。 聚丙烯酰胺由丙烯酰胺单体和甲叉双丙烯酰胺聚合而成。 三、脉冲电场凝胶电泳（PFGE）（Pulse-field gel electrophoresis ） PFGE是交替变换电场方向的电泳，以一定的角度一定的时间变换电场方向。 DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间取决于它的大小。分子越大，改变构象的时间就越长，重新定向的时间就越长，移动也就慢，反之越快。 可区分长度为50-100Kb以上，甚至Mb级别的大片段DNA分子。 第二节 分子杂交技术 杂交的基本原理 探针及探针标记 杂交的基本方法 一、基本原理 变性与复性 二、探针与探针标记 探针（probe）：用作检测的被标记的短片段特异DNA或RNA序列。 （一）探针的种类 基因组DNA探针、 cDNA 探针、寡核苷酸探针、RNA探针 （二）标记物 同位素标记：32P、35S、3H等 非同位素标记：地高辛、生物素、荧光素等 Klenow DNA 聚合酶 3’末端补平反应 T4多核苷酸激酶 5‘末端引入标记磷酸基团 末端转移酶 3‘末端连接标记的核苷酸 用T4多核苷酸激酶标记DNA5ˊ末端 p-CGA……CG-OH 三、分子杂交的基本方法 Southern 杂交 Northern杂交 Western杂交 菌落（噬菌斑）原位杂交 斑点杂交 （一）Southern杂交 1975年，英国Edwen Southern创建 检测DNA杂交方法，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。 Southern 杂交主要用来判断某一生物样品中是否存在某一基因，以及该基因所在的限制性酶切片段的大小。 关键技术 1、Southern印迹转移：核酸样品在凝胶上进行分离后，通过影印的方式转移到固相支持物滤膜上的过程。 2、分子杂交：将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记的DNA/RNA探针进行杂交。 1、Southern印迹转移 可以通过毛细管虹吸法或电转移或真空转移的方式，将凝胶上的 DNA 转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上。最后通过 80℃ 处理或紫外线照射将 DNA 固定在滤膜上。 2、分子杂交 ?预杂交????将结合了 DNA 分子的滤膜先与特定的预杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精 DNA 或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附。 杂交????在一定的溶液条件和温度下，将标记的核酸探针与滤膜混合，如果滤膜上的 DNA 分子存在与探针同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而吸附在滤膜上。 洗膜????经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去。 1.待测DNA样品的制备、酶切 2.待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 3.凝胶中DNA的变性：碱变性 4.Southern转膜(印迹)： 毛细管虹吸印迹法、电转移法、真空转移法 5.Southern杂交(预杂交、杂交、洗膜) 6.杂交结果的检测：放射性自显影/生化检测 （二） Northern 杂交 检测特定RNA（主要是mRNA）分子的方法 与Southern杂交的不同 靶核酸：RNA RNA