动态高压微射流术对酶的活性与构象变化的影响.pdf

摘要 摘 要 动态高压微射流(DHPM)是～种新兴的非热技术，集高速撞击、高频振 荡、瞬时压降、高速剪切和气穴作用于一体，压力可高达200MPa，这种新 技术不仅基于高压能力，并且基于不同几何学设计的反应腔(chamber)而获得 10—15倍传统阀式均质机，连续操作费时短也不同于静高压。本课题旨在 研究DHPM对多酚氧化酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的活性与构象变化的影 响，尤其关注的是在去折叠态下酶学性质、动力学、稳定性和构象变化的分 子机理。 本文研究了中国早酥梨多酚氧化酶的酶学性质和动力学，以邻苯二酚为 底物，测得其Vm戤为289．2units／rnin和Km为3．8mmol／L，表明早酥梨多酚 氧化酶对邻苯二酚具有较高的亲和性；催化反应速率与其浓度成正比；最适 pH和温度分别为4．5和45℃。研究了DHPM对早酥梨多酚氧化酶活性影响， 表明随着处理压力增加，相对活性从未处理的100％升高至180MPa的 182．5％；同等压力下，相对活性随着处理次数的增加而增加；酶液温度(25、 35和45℃)在120和140MPa处理条件下影响较大。 DHPM对香菇多酚氧化酶处理也是活性升高。处理压力和次数对香菇多 酚氧化酶有显著影响，在110MPa处理一次，其相对活性最高达l10．7％；在 3次后相对活性为111．5％。研究了香茹多酚氧化酶的活性与分子构象的机 理，圆二色谱显示其二级结构如a．helix遭到破坏，揭示相对活性的提高与 其仅．helix含量下降有关，荧光光谱显示香茹多酚氧化酶的Vrp和Tyr残基或 多或少暴露于溶剂中，这一结果与紫外光谱分析相符，巯基测定表明香菇多 酚氧化酶表面的巯基基团含量增加。我们发现经DHPM处理后，香茹多酚 氧化酶二级结构发生改变，分子构象处于去折叠态。 MPa处 DHPM对胰蛋白酶的活性没有显著影响，80、100、120和160 理后，胰蛋白酶相对活性分别保留98．5％、98．3％、97．8％和97％。但DHPM 处理显著提高了胰蛋白酶的热稳定性和pH稳定性，表现在：45℃保温100min 80MPa处理的胰蛋 后，未经处理的胰蛋白酶残留活性为86％，而经DHPM 摘要 80、 白酶残留活性为96％；DHPM对胰蛋白酶最适pH值没影响，而经DHPM 对活性分别为97％，102％及103％。对胰蛋白酶构象变化分析表明，动态高 压微射流处理后胰蛋白酶荧光强度增强、游离巯基含量增加，总巯基含量减 少、紫外吸收强度减弱、伍．helix强度减弱。这说明DHPM处理导致胰蛋白 酶的分子构象部分去折叠态。这一成果进一步印证我们关于天然热力学最稳 态不一定是其活性最高态的理论假设。 胰蛋白酶经DHPM处理后构象部分去折叠态导致其反应稳定性增强。 根据热动力学假设，去折叠态的胰蛋白酶并不是处在能量最低状态，而是处 于一种热力学不稳定的过渡态，随时可能进行refolding或聚集而丧失其反应 稳定性。我们提出新的设想：在酶(或蛋白质)的过渡性构象中，通过Patch the the amino in surface(补丁法)、Dowel exposedacid(桩法)、Wedgeg印 betweenamino acids(楔法)三种方式来固定其不稳态的去折叠态构象从而 维持其更高活性的策略和理论设想。本实验采用mPEG．SC修饰即补丁法策 增强。在40C贮存8后，NT和NTP变化不大，分别保持61％和59．9％； 分别保持在78％和74％，而未修饰的D80T和DlooT相对活性分别陡降到 oC处理10 56．5％和50％；热稳定性方面，55 min后，DsoTp和D100Tp相对 活性均保持在87％左右，而D80T和DlooT仅存70％的相对活