硕士研究生课现代分子生物学基础知识DNA重组李恩民创新.pptVIP

* DNA重组 DNA重组技术 一、 DNA重组技术相关概念 二、 DNA重组技术基本原理 一、 DNA重组技术相关概念 （一） DNA克隆 （二） 工具酶 （三） 目的基因 （四） 基因载体 （一） DNA克隆 所谓的DNA克隆就是DNA分子扩增的过程。 通常首先将某一目的DNA片段插入一适当的载 体中，构建重组复制子，继而转化宿主细胞并 筛选出含有重组复制子的细胞，然后进行扩增 即可以获得大量的目的DNA分子。上述过程即 为DNA克隆。 工 具 酶 功 能 限制性核酸内切酶：识别特异DNA序列并切割之 DNA连接酶： 缝合DNA分子上的单链切口，使两个线型DNA 分子的平端或匹配粘端相互连接在一起。 DNA聚合酶 I： 1) 填补3’凹端， 2) DNA测序， 3) 合成cDNA 的第二条链， 4) 缺口平移制作高比活探针 。 反转录酶： 1) 合成cDNA的第一条链， 2) 替代DNA聚合酶 I 填补3’凹端，3) 制作单链DNA探针，4) DNA测序 多聚核苷酸激酶： 催化多聚核苷酸5’羟基末端磷酸化以标记探针。 末端转移酶： 在DNA 的3’羟基端进行同质多聚物加尾。 碱性磷酸酶： 去除线型DNA 分子5’末端的磷酸基。 （二）DNA重组技术相关工具酶 限制性核酸内切酶特异性酶切位点的结构特点 restriction endonuclease recognized sequence and nick BamH I EcoR I GAATTC CTTAAG GGATCC CCTAGG 5’ Pvu I Sst I GAGCTC CTCGAG CGATCG GCTAGC 5’ Alu I Sma I AGCT TCGA CCCGGG GGGCCC 5’ （三） 目的基因（target gene） 所感兴趣的基因就是目的基因。 目的基因的来源 source of target gene * 直接来源于基因组 It is from genomic DNA of organisms directly, this is generally only prokaryotic gene. * 来源于人工合成 It is from artificial synthesis, this is generally simple polypeptide gene. * 来源于mRNA It is from mRNA. * 来源于cDNA文库或基因组文库 It is from genomic library or cDNA library. synthesize cDNA from mRNA AAA…AAA 5’ 3’ mRNA AAA…AAA 3’ 5’ AAA…AAA TTT...TTT 5’ 3’ 5’ 3’ primer: oligo dT reverse transcriptase TTT...TTT 5’ 3’ basic hydrolysis TTT...TTT 5’ 3’ ? TTT...TTT 5’ 3’ AAA…AAA DNA polymerase I TTT...TTT 5’ 3’ AAA…AAA 3’ 5’ S1 nuclease ge