RTPCR及琼脂糖凝胶电泳原理与结果..ppt

琼脂糖凝胶电泳的操作过程 1g 琼脂糖加入100ml 1×TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。（冷却到60℃，加入5μl的goldview，并摇匀。） 装好制胶板，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入，室温冷却凝固。 充分凝固后，小心垂直向上拔出梳子，将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm。 琼脂糖凝胶电泳的操作过程 用移液器吸取PCR产物10μl于封口膜上，再加入2μl 的6X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。 打开电源开关，调节电压至50-100V，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min。 将凝胶置于凝胶成像系统，打开紫外灯，可见到发出荧光的DNA条带。 琼脂糖凝胶电泳的操作过程 琼脂糖凝胶电泳的注意事项 配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的DNA分子大小来确定。 琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围 RT-PCR及琼脂糖凝胶电 泳原理与技术 RT-PCR（reverse transcriptional-PCR） RT-PCR原理 DNA聚合酶 mRNA cDNA 杂化双链 PCR扩增 RT-PCR主要用途 检测特异基因的表达量 特异基因的组织定位 构建cDNA文库 鉴定已转录序列是否发生突变 RT-PCR反应体系 10×buffer 2 ul Mg2+ 4 ul dNTP 2 ul Rnase Inhibitor 0.4ul AMV RnaseXL 0.4ul AMV-Taq 0.4ul H2O 3.8ul 引物Ⅰ 1 ul 引物Ⅱ 1 ul RNA(≤1ug) 5 ul 一步法RT-PCR RT-PCR反应体系 Components Volume(μl) RNA 8(1μg) 5xR.T.buffer 4 dNTPs(10mmol/L) 2 Primer 1 Rnasin(50U/μl) 0.4 AMV-RT((10U/μl) 1.0 DEPC-H2O 3.6 Total 20 两步法RT-PCR Components Volume(μl R.T.Product 5.0 10xPCR buffer 2.5 MgCl2(25mmol/L) 2.5 Primer1 1 Primer2 1 Taq DNA polymerase 1 ddH2O 12 Total 25 cDNA PCR扩增 cDNA第一链合成反应 实验目的 了解RT-PCR的基本原理。 熟悉RT-PCR的常规步骤。 掌握琼脂糖凝胶电泳技术。 实验要求 掌握PCR技术。 学会操作PCR仪。 熟悉琼脂糖凝胶电泳技术。 实验原理 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。 实验原理 PCR是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法，其特异性是由两个人工合成的引物序列决定的。在DNA聚合酶催化的一系列合成反应中，用两段寡核苷酸作为反应的引物。一般情况下，这两段寡核苷酸引物的序列互不相同，并分别与模板DNA两条链上的各一段序列互补；而这两段模板序列又分别位于待扩增DNA区段的两侧。反应时，首先是在摩尔数过量的两段寡核苷酸及4种dNTP存在下，将模板进行加热变性。随之将反应混合物冷却至某一温度，使引物与它的靶序列进行配对，称为退火。然后，退火引物可在DNA聚合酶作用下进行延伸。上述过程是由温度控制的。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环。 实验原理 PCR是在合适条件下的这种循环的不断重复。PCR按照底物（即模板DNA）的来源和引物的特点可分为经典PCR、逆转录PCR（RT-PCR）和免疫PCR（IM-PCR）。其中，RT-PCR较常用。在这个反应体系中，被检物为RNA，如mRNA，需借助逆转录酶的逆转录作用，转变为相应的互补链DNA（cDNA）才能进行PCR。为此，逆转录和PCR分两步进行，先作逆转录获得cDNA，再以此为模板作PCR。 RT-PCR的准备--试剂 提取细胞或组织中RNA 购买RT-PCR试剂盒（一步法或两步法） RT-PCR的准备--耗材、仪器 超净台 PCR仪 移液器 吸头 200ul PCR管 EP管架 枪头盒 PCR板 冰盒 RT-PCR过程中cDNA第一链合成反应所用的枪头、枪头盒、PCR管等塑料