大肠杆菌来源的pv6_l1重组蛋白的基础及应_用研究博士论文.docVIP

学校编码：10384 分类号 密级 学号：B200426027 UDC 博 士 学 位 论 文 asic and Application Studies on E. coli Derived HPV6 L1 Recombinant Protein 潘晖榕 指导教师姓名：夏宁邵 教授 专 业 名 称：生物化学与分子生物学 论文提交日期：2008年11月 论文答辩时间：200年12月 学位授予日期： 答辩委员会主席：田德英 评 阅 人： 2008年 11 月目录 目录 I 摘要 1 Abstract 3 缩略词 5 前言 7 1. HPV研究回顾 7 2. HPV的结构 7 2.1. HPV基因组结构 7 2.2. HPV的早期蛋白 8 2.3. HPV晚期蛋白与病毒结构 10 2.4. 二硫键与HPV 颗粒结构 13 2.5. L1蛋白的自组装 14 2.7. L2蛋白 15 3. HPV的分型 16 4. HPV的感染以及致病机制 17 5. HPV的免疫 19 5.1. 抗HPV的天然免疫 20 5.2. 抗HPV的特异性免疫 20 5.3. HPV免疫低反应性以及免疫逃逸的机制 22 6. HPV感染的诊断 23 6.1. HPV DNA检测 23 6.2. HPV抗体检测 24 7. HPV流行情况以及所致疾病 24 7.1. 高危型与低危型HPV 24 7.2. HPV感染的传播 25 7.3. HPV感染的流行情况 25 7.4. 高危型HPV感染所致疾病 29 7.5. 低危型HPV感染所致疾病 29 8. HPV疫苗研究现状 32 8.1. HPV疫苗的基本要求 32 8.2. 现有的HPV疫苗 33 9. 蛋白质结构研究及预测 38 9.1. 蛋白质结构研究的实验方法 38 9.2. 蛋白质结构研究的预测方法 39 9.3. 蛋白结构预测在抗体模拟上的应用 45 9.4. 抗体模拟技术的应用前景： 46 10. B细胞抗原表位定位的研究方法 47 10.1. B细胞表位的预测法 47 10.2. B细胞表位定位的实验方法 49 11. 本文研究的思路，目的和意义 51 材料与方法 53 1. 材料 53 1.1. 主要设备 53 1.2. 菌株、质粒、实验动物 54 1.3. 工作站、软件及其使用模块 55 1.4. 酶和单抗 55 2. 方法 55 2.1 常用溶液及培养基配制 55 2.2 常规分子生物学实验方法 57 2.3 HPV6 L1相关的克隆构建，表达纯化以及检测方法 62 2.4 疫苗原液及成品检定方法 66 2.5 分析型超速离心机相关操作 67 2.6 蛋白质晶体培养 69 2.7 圆二色光谱测定 70 2.8 抗HPV6标准血清的制备 70 2.9 HPV6单抗的制备,鉴定与CDR区测序 71 2.10 分子模拟与分子对接 77 结果与分析 81 第一部分HPV6 VLP疫苗的研究 81 1. HPV6 VLP小量制备方法的建立 81 1.1. 大肠杆菌重组表达质粒pTO-T7-6N5C的构建 81 1.2. HPV6N5-Ll在大肠杆菌中的可溶性表达 82 1.3. 重组蛋白HPV6N5-Ll的色谱纯化 84 1.4. HPV6VLP组装条件的摸索 87 1.5. 小结 90 2. HPV6 VLP疫苗的中试研究 90 2.1. HPV6N5C-L1的高密度发酵表达 90 2.2. HPV6N5C-L1的中试规模粗纯 90 2.3. HPV6N5C-L1的中试规模色谱纯化 91 2.4. HPV6 VLP的大量组装 92 2.5. HPV6 VLP疫苗中试工艺的评价 93 2.6. 小结 95 3. HPV6 VLP疫苗免疫原性的考察 96 4. HPV6 VLP疫苗原液稳定性的考察 98 5. 第一部分小结 103 第二部分HPV6 VLP疫苗的结构分析及表位定位 103 1. HPV6 VLP疫苗的结构分析 103 1.1. HPV6N5C-L1一级结构的研究： 103 1.2. HPV6N5C-L1二级结构的研究 105 1.3. HPV6N5C-L1 五聚体结构的研究 105 1.4. HPV6N5C-L1 VLP结构的研究 113 1.5. 小结 115