小反刍兽疫病毒体、抗原免疫学检测方法和纳米金核酸检测方法的建立.pdf

摘 要 小反刍兽疫是能感染家养及野生小反刍动物的一种传染性疾病。目前，小反刍兽疫呈现蔓 延的趋势。2007年我国西藏地区发生小反刍兽疫疫情，这是我国首次有该疾病发生的报道，因 此建立灵敏、特异、快速的检测方法对于早期发现小反刍兽疫非常重要。本研究旨在建立能快 速且特异检测小反刍兽疫抗体、抗原和核酸的分子生物学和免疫学方法。 利用从奥地利引进的PPRVN基因全长质粒，根据N蛋白序列的保守性分别设计5对引物 N亚单位蛋白的原核重组表达质粒。将亚单位蛋白进行纯化，并通过Westernblot和ELISA进 行鉴定。Western blot分析表明除第3亚单位蛋白以外，其余亚单位蛋白均具有反应原性。ELISA 鉴定结果表明，PPRVN蛋白的B细胞表位主要位于第5亚克隆区域，即N蛋白的第Ⅳ区域。 化，优化后的间接ELISA检测方法具有较高的特异性和灵敏性，与标准竞争ELISA的符合率 高达98．4％。 白及anti．goat 等组装成胶体金试纸条。所制各的胶体金试纸条可以特异性的检测PPRV抗原，检测极限达到 10 ng，该方法具有良好的特异性，操作简便，可广泛应用丁基层检测。 针对PPRV N基因设计一对探针，分别在5’端和3’端修饰上巯基和生物素。将巯基化的 探针标记至柠檬酸钠还原法制备的纳米金颗粒上，制备纳米金核酸探针，将纳米金核酸探针与 靶序列及生物索标记的探针进行杂交，杂交体系转移至亲和素包被的酶标板中，通过银染增强 法进行显色。通过对银染显色时间等条件的优化建立了银染增强纳米金核酸探针检测PPRV的 方法，该方法可以定量检测靶核酸，最低检测量为10 pmol／L。 本研究共建立3种检测方法分别用于检测小反刍兽疫抗体、抗原及核酸，为小反刍兽疫的 检测及监测建立了技术平台。 关键词：小反刍兽疫病毒；亚克隆；间接ELISA；胶体金免疫层析：纳米金核酸探针 Abstract Pestedes a viraldisease domesticandwild petitsruminants(PPIt)，iscontagious higly affecting smallruminants．In recent tonewareasintheworld．PPRwag in years，it outbroken spread firstly Tibet ofChinain 2007．Itbecomesmore and criticalforUStoreinforcestudieson July necessary andcontrolofthedisease． diagnosis the whichcontainsthe PPR、，N andfive of Usingplasmid complete gene pairsdesignedprimers totheconservatismofN five subunitswere the according gene，the PCR．Thensubunits amplifiedby were into cloned