伪狂犬病的鉴定和分离精品.pptVIP

在此输入文字标题 伪狂犬病分离鉴定 * 队长：王晓勤 队员：李霞梅 刘权剑 ——————雷神队 一 背 景 现 状 三 分 离 鉴 定 二 目 的 意 义 四 优 势 分 析 一 背景现状 定义：猪伪狂犬病是由猪疱疹病毒1型 引起的一种急性传染病 临床表现：发热、发痒、腹泻、 呕吐、 生长不良、脑脊髓炎等 病理严重性：引起种猪不育、妊娠母猪呼 吸症状、流产、产死胎及木 乃伊胎，育肥猪增重减慢等 流行性：呈世界分布，是危害全球养猪 业的主要传染病之一 感染对象：几乎所有年龄和品种的猪， 且仔猪发病率、死亡率高 目前治疗状况：本病尚无有效药物治疗 ，只能通过预防控制 保持环境卫生、加强管理、消灭鼠类等病毒传播源 对病死尸体、污物及场地严格消毒、无害化处理 提高检疫频率，对阳性猪隔离淘汰，直到全部呈阴性 培养健康幼猪，建立无病猪群 严格将牛、猪等分开饲养 二 目的意义 猪伪狂犬病病毒可引起多种家畜和野生动物的伪狂犬病，具有重要经济意义 研究伪狂犬病病毒可控制其传播，增加猪的育种率及健康程度从而增加经济效益推动养猪业的发展 目前分离鉴定所需的各种技术已成熟，实验可行性较高 Hanks液、离心机、0.22微米微孔滤器、小鼠 病料：来自某猪场发病仔猪 细胞与培养基： PK-15、 BHK-21细胞；MEM培养基； 新生牛血清 鸡胚及试验动物：在实验室孵化至10日龄后的种蛋 PRV标准毒株及阳性血清 PCR引物：根据PRV gD基因库设计的特异性引物： P1:5- ATTTGAATTCCCCAGG-3 P2:5- CTTGAAGCTTGGCAG- 3 三 分离鉴定 .实验材料 （一）病料处理 采集某发病猪场病死仔猪的鼻腔粘液 、脑 、脾脏、 肾脏、 淋巴结等组织材料 加入5倍量Hanks液(pH7.0，内含青、链霉素各1000U/mL)，研磨成匀桨， 冻融3次后，4 ℃过夜 于4000 r/ min 离心20min，取上清液用0．22 微米微孔滤器过滤除菌 检呈阴性后置于－70 ℃保存，作为分离病毒的材料 三 分离鉴定 .实验步骤 （二）病毒分离 分离取上清液接种于PK-15和BHK-21细胞， 37 ℃作用1h，期间每隔20min摇晃一次，作用完毕弃去接种物 加入含有2%新生牛血清的MEM维持液，并设空白对照和阳性对照（PRV闽A株） 每日观察2次，观察5d，当接种细胞出现细胞病变(CPE)，并达到80%以上病变时收获传代，分离病毒株并连续传至F7代，以适应细胞生长 三 分离鉴定 .实验步骤 （三） 毒价测定 取分离病毒株的F7 代毒株作10倍系列稀释（10-1～10-10），接种于已长成单层的PK-15细胞96孔细胞板，每个 稀释度接种8孔，每孔接种 0.1mL 第 11、 12 列为2%新生牛血清的MEM维持液做空白对照。 连续观察7d，记录各个梯度的病变数，按Reed-Muench 法计算分离毒株的病毒半数细胞感染量（TCID50） 三 分离鉴定 .实验步骤 （四） 中和试验（用固定病毒稀释血清法） 将PRV阳性血清分别进行2倍、 3倍、 5倍稀释 再加入等量体积并稀释至200个TCID50 分离毒株，37 ℃作用1h，每个稀释度做4次重复 分别接种于已长成单层的PK-15细胞板，设维持液空白对照和PRV闽A株阳性对照 连续观察5d，记录各个稀释度的细胞病变数 三 分离鉴定 .实验步骤 （五）荧光抗体试验 . 开始出现细胞病变时，用丙酮固定10 min 滴加猪伪狂犬荧光抗体覆盖在飞片表面，置37 ℃湿盒中感作45 － 60 min 用 PBS 液洗涤，风干 再用0．5 mol L － 1碳酸盐缓冲甘油( pH9．5) 封片，置荧光显微镜下观察 三 分离鉴定 .实验步骤 （六）鸡胚绒毛尿囊膜接种 将上述的分离毒株培养物接种于3枚10日龄鸡胚绒毛尿囊膜，每枚接种0.2mL，并同时设同剂量的2%新生牛血清的MEM维持液接种鸡胚作为对照， 37 ℃孵化144h，每日照蛋2次。弃去24h死亡的鸡胚，观察24~144h死亡和未死亡的鸡胚绒毛尿囊膜是否有痘斑形成 三 分离鉴定 .实验步骤 （七）分子病毒学鉴定