avm诱导王鸽神经细胞凋亡的内质网通路研究.pdf

摘 要 摘 要 阿维菌素（avermectin，AVM ）在农业和畜牧业中大量应用并造成严重的环境毒性。以 往研究表明鸽子 AVM 中毒可引起明显的神经症状、脑组织出血和水肿以及脑神经细胞凋亡 等变化，证实了 AVM 能诱导体外培养神经细胞凋亡并且研究了引起细胞凋亡的线粒体途径， 但是关于另一条导致细胞凋亡重要的途径—内质网途径未见报道。 本试验以体外培养王鸽脑神经细胞为研究对象，在培养液中添加 2.5μg·L-1 、5μg·L-1 、 -1 10μg·L 三种剂量 AVM ，进行 6h、12h 和 24h 不同时间段的染毒处理，通过对王鸽脑神经细 胞的存活率、细胞凋亡率、细胞内氧化应激反应指标以及细胞内 Bcl-2 、Cyt-c、DADD153 、 GRP78 和 Caspase-12 mRNA 表达等进行观察和检测，探讨了 AVM 对鸽神经细胞毒性作用的 剂量效应关系和时间效应关系，以阐述 AVM 对神经细胞影响的内质网机制。研究结果表明： 1.应用透射电镜、MTT 法以及 TUNEL 法，观察培养液中添加不同剂量 AVM 在培养不 同时间对神经细胞毒性作用，从形态学角度观察 AVM 能够引发神经细胞凋亡，且明确细胞 凋亡率与 AVM 作用程度呈线性相关； 2.应用氧化应激系列检测试剂盒，检测细胞内活性氧（ROS ）的产生、谷胱甘肽过氧化 物酶（GSH-Px ）活性和超氧化物歧化酶（SOD）活性情况，结果显示AVM 能引起神经细胞 氧化应激，谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px ）活性下降，超氧化物歧化酶（SOD）活性降低， 活性氧（ROS ）水平升高，且呈剂量效应和时间效应，提示 AVM 可通过氧化应激引起内质 网应激，进而开启内质网凋亡途径介导细胞凋亡； 3.应用半定量 RT-PCR 法检测细胞内 Bcl-2 mRNA 表达水平，结果表明 AVM 能够引起鸽 神经细胞内 Bcl-2mRNA 表达水平下降，从而失去 Bcl-2 的保护作用，引起细胞凋亡； 4.应用半定量 RT-PCR 法检测细胞内 GRP78 mRNA 表达水平，结果表明试验组的 GRP78 mRNA 表达随着攻毒剂量的增加和染毒时间的延长而增加，在攻毒 5µg/mLAVM、24h 后达 峰值，随后降低，提示此时内质网自身的保护作用达到最佳水平； 5.应用半定量 RT-PCR 法检测细胞内 Cyt-c mRNA 表达水平，结果表明 Cyt-c 在正常情况 下的表达量较低，随着药物作用程度的增大而明显的增加，表明神经细胞凋亡的早期就已经 启动了 Cyt-c 的调控作用； 6.应用半定量 RT-PCR 法检测细胞内 GADD153 mRNA 表达水平，结果表明 AVM 能够引 起鸽神经细胞内 GADD 153mRNA 表达水平增加，进入其级联反应，通过内质网介导细胞凋 亡； 7.应用荧光定量 RT-PCR 法检测细胞内 Caspase-12 mRNA 表达水平，结果提示 AVM 能 够引起鸽神经细胞内Caspase-12 mRNA 表达水平增加，它作为内质网凋亡途径的标志性基因， 证明了 AVM 能够通过内质网途径引起细胞凋亡。 本试验从细胞形态、细胞凋亡、氧化应激、细胞凋亡的内质网途径相关分子的表达各个 方面阐明了AVM 毒性作用的内质网机制，为进一步研究AVM 对生物影响提供有价值的线索， I 东北农业大学农学硕士论文 充实了 AVM 毒理学资料。 关键词 阿维菌素；王鸽；神经细胞；细胞凋亡；内质网凋亡通路 II Abstract The research on endocytoplasmic reticulum pathway and apoptotic mechanism of cultured pigeon neurons induced