家蚕转基因的外基因导入法研究.pdfVIP

家蚕是一种重要的经济昆虫，也是遗传学研究的模式生物，其转基因研究在分子生物 学基础理论、新品种育成和基因工程产品的生产实践中都有重要意义。在家蚕转基因研究 中，一套高效的载体系统和简便易行的导入方法一直是人们追求的目标。针对这两个问题， 本实验进行了精子介导的外源基因导^方法和同源重组转座载体构建研究。 1精予fl嚼法向家蚕导入：州嬲馥野院 1．1质陂pFbGFP的陶建 段替换，得到熊用于家蚕转基因的由丝素基因启动子驱动的以绿色炭光蛋白为报告基因的 质粒pFbGFP，用于外源基因的导入研究。 1,2 I嫩pFbGFP向家蚕的胯刊惰时姆^ 以精子介导法的三种方式，即先注后交、先交后注和人工受精，向夏秋用蚕品种夏芳 导入质粒pFbGFP。收集处理蛾所产卵饲养检测。 13转pFbGFP蚕的分子5豳燃 l3．1转p硒GFP蚕的PCR植燃 Go代各蛾区随机取十头蚕后部丝腺混合提取DNA，以其作为模扳经引物特异扩增导 入的碰，基因(660bp)，以一定n率得到预期大小阳性片段，从而筛选到阳性区。阳性区 制种，所得各卵圈取50头孵化蚁蚕提取DNA作为模藏再以同样方法特异扩增，以一定 几率得到预期大小阳性片段，筛选出阳性卵圈(G1代)进行饲养。G1代随机留暇部分个 体制种。并对制种后的蛾分雌雄单蛾抽提DNA，检测其阳性情况(其中一种方式达到 40％)。 132转pFbGFP蚕Go、Gl代Sauthera检涮 pg，以EcoRI酶切后于O．7％琼 分别以十头G0代、Gl代PCR阳性个体D1qA各15 脂糖凝胶电泳，转移到Nc膜，以特异引物扩增质粒pB肺奔ER得至IJ的g勿基因片段作 为探针，杂交均得到阳性结果。n．乎所有G1代PCR阳性蛾得到撇的验汪，对亲代 有阳性的卵圈保留继代。 2同源堕绷嘲啡pTRS41N的陶蜮斑翩靳蝽驰啪Ii圣母入 2．1同潦尉圆翩燃pTR54IN撇 本实验设计引物特异扩增家蚕转座子中度重复序列TRASl开放阅读框前的两个片 (Immediate Early．IE)蛋白启动子刺的新霉素抗性基因耐的载体piN表谧两端 的同源重组臂，得到用于家蚕转基因的同源重组转座载体pTR541N。 址期确醛爆柏瞰删瑟融黼 以基因枪法分20次向约10000粒产下2小时内的受精卵轰击，导入线性化质粒 pTe,54IN．导入后的蚕卵孵化饲养、检测。 23转趋团尉鼬啕浔铀粼 在GO代转基因个体中检测到了对所导入的基因ned的PCR阳性扩增，扩增产物得 保种。 本实验必精子介导法向蚕卵导^所建屈骷pFbGFP，曰鹫封晰弋从基因组DNA检测 到所导，M卜溅因．斫，的PCR、Southern杂交阳性，其中—种导入力式到熙二代阳性率为 400。说明精予介导法用于外源基因向家蚕的导入是可行的。我们特异扩增家蚕转座子、 中度重复序列TRASl嬲谢韵拍两个片l戮作为同醵重组引导序列构建同源重朔醋 座载体：以基因枪法导入载体同源臂以内的线性片段，在G0代转基因4．体oe检涣桎0了对 提取DNA做PCR检测，得到爵令悃性卵圈。说明本实翻荆黜I司源重组载f{．可甩于 家蚕转基因研究．所采用的基因枪轰击条件可将外源基因导入蚕卵。 关键词家蚕(脚棚曲、转姻、糟酣 同潦巍鼬岗雠。 ABSTRACT researchof insectand Tmnsgenic Silkworm(Bombyx economic model roOF0，all important for all mIein organisnl and genetics sc咖啦playsimpo咖t theory molec