猪红细胞自身全凝集双功能试剂的研制.pdfVIP

摘 要 利用杂交瘤技术研制出抗猪红细胞膜非凝集型单克隆抗体,对单克隆抗体的特性进 行鉴定，通过化学偶联制备双功能试剂，探索了氯霉素残留快速检测方法，为食品安全 快速检测提供技术借鉴。 从健康猪血中离心分离猪红细胞膜蛋白作免疫原，免疫 BALB/c 小鼠，取免疫脾淋 巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0 作融合实验，细胞比例为 6：1；融合后的细胞经早期培 养，ELISA 初筛和玻片红细胞凝集试验剔除凝集型单抗，筛选出的阳性细胞，采用有限 稀释法进行多次克隆、扩培、冻存；制备无血清细胞培养上清，常规法制备腹水；辛酸 -硫酸铵沉淀法结合 DEAE 离子交换树脂对腹水进行纯化，制备单克隆抗体。通过两次 融合试验，融合率 85%，间接 ELISA 共筛选出 5 株抗猪红细胞的杂交瘤细胞株,通过凝 集试验剔除 2 株凝集型细胞株，共获得 3 株抗猪红细胞非凝集型单克隆抗体细胞株，分 别命名为：1C-1、1C-2、2C-1 。 采用间接 ELISA 法、间接抗球蛋白实验、白蛋白铺层实验，对无血清培养上清的 效价测定，三种细比较表明，间接 ELISA 法灵敏度最高，间接抗球蛋白法次之，白蛋 白铺层法最次，确定试管法间接抗球蛋白血凝试验测定腹水抗体效价；腹水抗体效价在 1：80-1：320 之间，其中 2C1 凝集效价比较高，达到 1：320 ；单抗经多次冻存、传代 后，稳定分泌抗体；采用双向琼脂扩散和间接 ELISA 法测定单抗亚型，结果表明，3 株 单抗均为 IgG，IgG1 亚型；秋水仙素阻断法测定单抗细胞染色体数在 95-106 之间；抗 体经辛酸-硫酸铵和 DEAE 离子交换树脂纯化后可达到电泳纯；与其它种属无交叉反应； 3 株单抗均达到临床使用的 ABO 单克隆抗体试剂（IgM ）的亲和力标准 ，其中 2C1 亲 和力最高；具有免疫学活性。 酶解还原法制备 Fab 片段。羰基二咪唑法合成 BSA-CAP 结合物，测定蛋白浓度， 在戊二醛的作用下抗氯霉素单克隆抗体和 Fab 片段偶联，制备双功能抗体，测定其效价、 耐热性、耐冻溶性，偶联后抗猪红细胞膜 Fab 片段和抗氯霉素抗体均保持良好的活性， 探索了自身红细胞凝集抑制试验测氯霉素残留的方法。 制备了 3 株抗猪红细胞膜非凝集型单克隆抗体，对单克隆抗体的特性进行了全面的 I 鉴定，探索了氯霉素残留自体红细胞凝集抑制试验快速检测方法，可为其他动物源食品 中有害物质的检测提供技术借鉴，对食品安全监控提供技术支持。 关键词：食品安全；快速检测；猪红细胞；单克隆抗体；氯霉素； II ABSTRACT Objective: Using hybridoma technique, Non-agglutinating monoclonal antibodies (McAbs) against membrane antigen on swine erythrocytes were preparaied and characteristics were authenticated. Double function reagent was developed by glutaraldehyde (GA) .The rapid detection methods of CAP were explored with this McAb. The membrane antigens of swine erythrocytes was separated from healthy blood of swine and BALB/c mice were immunized .The splenocytes of the immunized mice were fused with SP2/0 myeloma cells(6:1) by hybridoma technique. The antibodies to common antigen on swine erythrocytes were screened by ELISA then the agglutinating antibodies wer