免疫荧光摘要.pptVIP

免疫荧光技术 陈海蓉 一、一些基本概念和基本知识： 1 荧光免疫测定技术的概念：将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧光素，这种免疫技术，称为免疫荧光素技术 2.技术分类： ⑴荧光抗体技术(荧光显微镜技术) 抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判 定结果的检测方法 ⑵ 免疫荧光测定技术： 抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定 荧光强度而推算被测物浓度的检测方法 荧光的产生： 物质吸收外界能量而进入激发状态，在回复基态时多余的能量以电磁辐射的形式释放，即发光，这种光称为荧光。这种物质称为荧光素 由光激发所引起的荧光，为光致荧光 ------荧光免疫技术 由化学反应所引起的荧光，为化学荧光 ------化学发光技术 荧光素的荧光特性： ⑴ 停止供能，荧光现象随即终止 ⑵ 对光的吸收和荧光的发射具高度选择性 入射光波长发射光波长 ⑶ 荧光效率： 发射荧光的光量子数 荧光效率= 吸收光的光量子数 ⑷ 荧光猝灭现象：荧光素的辐射能力减弱 5 常见荧光素： ⑴ FITC ⑵ RB200 ⑶ TRITC ⑷ 镧系：Eu、Tb ⑸ PE ⑹ 其它 常见荧光素的特性： ⑴ FITC：黄色结晶粉末，吸收光：490~495nm， 发射光：520~530nm，明亮的黄绿色荧光 ⑵ RB200： 橘红色粉末, 吸收光570nm，发射光 595~600nm，橘红色荧光 ⑶ TRITC： 紫红色粉末，吸收550nm，发射光 620nm，橙红色荧光 ⑷ 镧系：Eu、Tb ⑸ PE：吸收光490~560nm，发射光595nm，红色 荧光 ⑹ 其它：酶作用后产生荧光物质 合适荧光素的选择 ⑴ 具有与蛋白质形成共价键的化学基团 荧光素-N=C +NH-蛋白质 荧光素-N-C-N-蛋白质 ‖ ︱ ︱‖ ︱ S H H S H ⑵ 荧光效率高，标记后下降不明显 ⑶ 荧光色泽与背景色泽对比鲜明 ⑷ 标记后能保持生物学活性和免疫活性 ⑸ 标记方法简单、快速 ⑹ 安全无毒 7 标本的固定： ⑴ 固定目的 防止细胞、细菌或切片从玻片上脱落 去除组织中妨碍抗原抗体结合的类脂质 易于保存 ⑵ 常用的固定方法： 抗原 固定剂 固定方法 蛋白质 95%乙醇 室温3~10min或4℃30min Ig类 甲醇 同上 酶类 丙酮 同上 激素 CCl4 同上 类脂质 10%福尔马林 室温3~10min 多糖(细菌) 10%福尔马林 室温3~10min或4℃30min 丙酮、甲醇 病毒 无水乙醇 室温5~