南极深海沉积物中产低温脂肪酶菌株的筛选与基因克隆.pdfVIP

第33卷 第3期 应 用 海 洋 学 学 报 V0I．33．No．3 2014年 8月 JournalofApplied Oceanography Aug．，2014 南极深海沉积物中产低温脂肪酶菌株的 筛选与基因克隆 郝文惠’，王凡羽 ，郭 玉 ，汤熙翔 1．国家海洋局第三海洋研究所，福建 厦门361005；2．南华大学药学与生命科学院，湖南 衡阳421001 摘要：在 10％恒温培养条件下，从第29次南极科学考察获得的南极深海沉积物样品中分离筛选到 产脂肪酶细菌3株，产脂肪酶真菌 1株，对其进行分子生物学鉴定，确定为假交替单胞菌属 Pseud— oalteromonasarctica 、芽孢杆菌属 Bacilluspumilus 、Glaciecolasp．以及白冬孢酵母属 Leucosporidi— umsp． ．通过测定各酶的最适反应温度，获得产低温脂肪酶芽孢杆菌XZ18，该菌所产脂肪酶最适 反应温度为3O℃，在 0℃仍有部分活性．从NaC1浓度和 pH值 2个条件对产酶条件进行研究，最终 确定了该菌最适产酶NaC1浓度5．0％、最适产酶pH值为6，最高产酶量为4．65U／cm ．通过 PCR 扩增，获得 了脂肪酶全长序列，对该序列进行系统发育分析，发现该脂肪酶基因处于较独立的分支． 关键词：海洋生物学；极地；低温；脂肪酶；基因克隆 DOI：10．3969／J．ISSN．2095-4972．2014．03．002 中图分类号 ：P735 文献标识码：A 文章编号：2095-4972 2014 03-0306-06 南极独特的地理、气候及环境特征使其成为一 积物样品，进行了低温酶产生菌的筛选及基因克隆． 个有潜力的、重要的微生物资源宝库，是产生新型 分离得到产低温脂肪酶菌株XZ18，对该菌株最适产 生物活性物质和先导化合物 如酶、抗生素、多糖及 酶条件进行测定，确定该菌最适产酶 NaC1浓度是 脂类等 嗜冷菌的潜在种源地．有关极地微生物的 5．0％，最适产酶pH值是6．0，最高产酶量为4．65 资源勘探与代谢活性物质的研究，已成为国际微生 U／cm ，有较好的开发应用前景． 物学研究的热点之一 ¨ ． 1 材料与方法 脂肪酶是能够催化长链脂肪酸甘油酯水解和合 成的羧酸酯酶 ，是当代酶工业最受瞩 目的酶种之 1．1 材料 一 _6J，可在油水界面上催化脂类化合物分解、合成 1．1．1 样品采集 南极深海沉积物样品来 自“雪龙 和酯交换反应，该酶类广泛存在于动、植物体内和微 号”科学考察船第29航次科学考察，共4个样品，水 生物细胞中 j，而作为具有低温活性的低温脂肪酶 深2795～3502m，西经73。～83。，南纬63。～66。． 则大多是由低温微生物产生，酶的最适反应温度一 1．1．2 初筛培养基 产脂肪酶真菌筛选培养基的 般均低于40％，而在0℃仍具高酶活 ．这些低温 配制：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水 1dm 微生物主要分布在长期处于低温的环境，如南、北两 煮沸半个小时，纱布过滤，再加20g葡萄糖、1cm吐 极以及大洋底部等．目前所发现的产低温脂肪酶的 温 80和 15g琼脂，121℃条件下灭菌 20min．待冷 低温微生物大都属于假单胞菌属 Pseudomonas 、气 却至50℃左右时加入氯霉素 无水乙醇溶解 50mg 单胞菌属 Aeromonas 等 ”J．低温脂肪酶在造纸、 和链霉素50mg．产脂肪酶细菌筛选培养基的配制： 洗涤剂和食品工业中有一定的应用 t4]． 称取蛋白胨5g，酵母提取物 1g、NaC134g、CaC1：· 本文利用第29次南极科考采集的南极深海沉 H，01g、吐温801cm ，加水至 1dm。，121℃条件下 收稿日期 ：2014~1—17 基金项 目：南北极环境综合考察与评估专项资助项 目 CHINARE20134 I-06 ；国家海洋局第三海洋研究所基本科研业务费资助项 目 海三科 座机电话号码 作者简介：郝文惠 1989～ ，女，硕士研究生；E—mail：1座机电话号码04@163．c0m 通讯作者：汤熙翔 1974～ ，男，副研究员；E—mail：tangxixiang@hotmail．COlll 3期 郝文惠，等：南极深海沉积物中产低温脂肪酶菌株的筛选与基因克隆 灭菌20rain．2216E液体培养基的配制：称取蛋 白 底物溶液：将 37．5mgPNPP溶解于丙醇中，再将该 胨 5g，酵母提取物 1g，NaC134g，吐温 1cm ，加 溶液溶解于 50cm 含 50×10 mol／dm s／HCl 水至 1dm ，121℃条件下灭菌20rain．PDA液体培 pH 8．0 和0．1％TritonX一100的缓冲液中，终浓度 养基 ：称取200g马铃薯