li-key和ep-1携带异种病毒表位嵌合疫苗的构建及其体液免疫效应.pdfVIP

II 万方数据 摘 要 跨膜糖蛋白恒定链（invariant china,Ii）在抗原递呈细胞内主要参与主要组织相容 性复合体（MHC）Ⅱ类分子与抗原肽复合物的装配，其关键活性基团（Ii-Key）在此 过程中发挥重要作用。近些年，Ii-Key已被证实能够携带单一抗原或抗原肽，有效增 强细胞免疫和体液免疫。PEP-1 是一种人工设计的细胞膜穿透肽（Cell penetrating peptide,CPP），具有克服细胞膜的屏障作用跨膜转导能力，以非能量、非受体依赖性 的方式把蛋白质、肽段、寡核苷酸等跨膜转导入各种细胞的胞浆和胞核内。本文基于 Ii-Key和PEP-1载体上构建异源多表位串联肽新型疫苗，为双重防控鸡传染性法氏囊 Infectious Bursal Disease IBD Newcastle disease,ND 病（ ， ）和新城疫（ ）提供参考。 首先，本文构建了Ii-Key与鸡传染性法氏囊病病毒VP2肽表位（aa197-209）和 新城疫病毒HN 肽表位（aa345-353）的嵌合体，并将嵌合体基因插入pET-32a原核表 达载体，转化E.coliRosetta 通过IPTG 诱导表达，用镍柱亲和层析纯化融合蛋白，免 疫SPF级BAL b/c小鼠，分别通过间接酶联免疫吸附试验和免疫印记试验检测小鼠体 内的抗体水平和融合蛋白的反应原性。结果表明，与VP2/HN 串联表位对照组相比较， Ii-Key/VP2/HN 嵌合体疫苗处理组抗体效价平均提高了13.7倍。 其次，将PEP-1和PEP-1-Ii-Key串联载体分别与VP2/HN 表位连接构建嵌合体 （PEP-1/VP2/HN 和PEP-1-Ii-Key/VP2/HN），通过原核表达，融合蛋白的纯化，小鼠 免疫和间接-ELISA 检测抗体效价等方法，研究PEP-1 和PEP-1-Ii-Key 联合载体对 VP2/HN 串联肽免疫效应的影响。结果表明，与单纯VP2/HN 串联肽组相比，均能有 效刺激机体产生抗体（8.6和6.7倍，p0.05）。但同时也发现，PEP-1-Ii-Key联合载 Ii-Key p0.05 PEP-1 Ii-Key 体免疫增强效应明显低于 载体组（ ），表明 对 免疫增强效 应发挥负向调控作用。 为了探究Ii-Key 和PEP-1免疫增效作用是否与MHCⅡ类分子相互作用的加强有 关，本文在构建的原核重组质粒基础上，构建了真核表达载体 pmCherry-C1 与 VP2/HN、Ii-Key/VP2/HN、PEP-1/VP2/HN、PEP-1/Ii-Key/VP2/HN真核重组质粒，与 实验室保存的pEGFP-N1-MHCⅡα真核重组质粒转化大肠杆菌DH5α，使用无内毒质 TM 粒抽提试剂盒抽提后取适量重组质粒通过脂质体Lipofectamine 2000 转染293T 细 胞，转染24h后使用激光共聚焦显微镜下观察定位情况。结果表明，各处理组均能在 胞内与MHCⅡ类分子发生共定位，但是各组间差异不明显。表明Ii-Key和PEP-1免 疫增效作用与其是否增加了VP2/HN 表位肽与MHCⅡ的相互作用没有明显关联。 综上所述，本文成功构建了VP2/HN 与Ii-Key或PEP-1嵌合体，发现单个载体 均能有效增强异种病毒串联抗原表位的体液免疫应答水平，但是PEP-1与Ii-Key联