gadd45αas2o3诱导肿瘤细胞凋亡反应中的作用及分子机制研究.pdfVIP

硕士论文 中文摘要 中的作用及分子机制研究 摘 要 arrest锄dDNA GADD45(growmdamage．induciblegene45)0c属于生长抑制及 损伤因素可迅速诱导GADD450【表达，并发挥细胞周期行进抑制、DNA损伤修 复、诱发衰老及促细胞凋亡等多种生物学功能。鉴于以上性质，GADD450c被认为 具有肿瘤抑制因子的潜能。但随着近年来一些全新研究结果的发现，GADD450c在 肿瘤抑制反应中的作用受到争议和质疑。有文献报道证实，GADD45a在某些外 晃刺激条件下的诱导表达能够发挥抗肿瘤细胞凋亡效应；而且一些临床实验结果 亦表明，GADD450c可在某些肿瘤组织中高表达。并与肿瘤细胞失去化疗敏感性和 病人低生存率直接相关。因此，GADD450【在肿瘤细胞生存与凋亡反应中的作用 及机制仍有待进一步阐明。 本研究以肝癌细胞HepG2为模型，以在血液系统肿瘤的临床治疗中己取得 As203诱导肝癌细胞凋亡反应中的作用及分子机制。在第一部分研究中发现： 续性表达。而当GADD450【的诱导表达被抑制后，As203的促细胞凋亡效应即明 分子。进一步研究发现， 能亚基。在正常人二倍体肝细胞HL7702中未发现As203刺激作用下 GADD450【册、『刚AP．1途径是介导As203 远远低于HepG2细胞。以上结果证明， 特异性诱导肝癌细胞凋亡反应的重要信号通路。 GADD450【是至今为止发现的表达调控最为复杂的细胞应激反应蛋白之一， 除在转录水平上受p53等转录因子的调节外，GADD45Q的诱导表达在转录后水 平、翻译水平和翻译后水平也受到多层次的调控。本课题组在近期工作中，首次 发现在正常二倍体细胞中存在一种与泛素化修饰反应相关的GADD45仅翻译后 硕士论文 中文摘要 诱导表达调控机制。因此，在阐明GADD45仪诱导表达介导HepG2细胞凋亡效 应的下游信号转导途径的基础上，我们在第二部分研究中又进一步探讨了As203 诱导GADD45仅表达的上游调控机制。结果发现，在HepG2细胞中同样存在 GADD450c的组成性泛素化修饰和蛋白质降解反应，从而使静息细胞中 白稳定性，导致其在蛋白水平的大量迅速聚集，此过程中不涉及GADD45a的转 录调控。为揭示HepG2细胞中GADD450【蛋白稳定性的调控机制，我们借助于 计算机辅助下的分子模拟，预测了GADD45a分子表面与其它信号调控分子(包 括E3泛素连接酶)发生相互作用的区域，并据此构建了一系列GADD45a突变 体，同时对这些突变体与野生型GADD450【的稳定性差异进行了详细分析。我们 发现，GADD45Ⅸ分子中含有两个与其蛋白稳定性调控密切相关的结构区域，这 两个区域突变后可导致GADD45仪的蛋白稳定性明显增加。随后，我们又通过酵 母双杂交实验，筛选可能参与调控GADD45Ⅸ蛋白稳定性的功能蛋白，希望以此 为突破口鉴定调控GADD45a泛素化修饰反应的E3泛素连接酶。结果显示，核 糖体小亚基蛋白S7能够下调GADD45仪的组成性泛素化修饰反应，提高其稳定 性并介导舡203刺激作用下GADD45a的诱导表达。尽管S7并不具备E3泛素连 接酶的性质，但通过研究S7调控的泛素化调节蛋白(例如MDM2)将可能为揭示 GADD45Ⅸ的泛素化修饰反应和蛋白稳定性的调控机制提供重要的研究基础。 IKK仆IF．KB途径是调控应激损伤反应中细胞生存与凋亡的关键信号通路。本 课题组在以往研究中发现，GADD45仪在正常二倍体细胞中介导的细胞凋亡反应 与介导NF．KB活化的上游蛋白激酶IKK仪和IKKp的功能密切相关。因此，在第 三部分研究中，我们还观察了IKK激酶在As203诱导细胞凋亡反应中的作用。我 们发现，As203诱导的细胞凋亡反应中伴有IKK仪和IKKD蛋白表达水平下调。进 一步的研究发现，这种现象在肿瘤细胞以及肿瘤抑制药物反应中普遍存在，且 IKKⅨ和IⅪ(D表达水平下调与NF．1(B在As203刺激作用下的诱导活化状态无关。 在对IKK0【和lKKD蛋白表达水平下调机制的研究中发现，IKKp表