β-连环素t细因子4信号通路在非小细胞肺癌的研究.pdf

13一连环素／T细胞因子4信号通路在 非小细胞肺癌的研究 中文摘要 目 的 肿瘤细胞是由正常细胞恶性转化而来，其信号传导机制与正常细胞存 在明显区别，其中既有量的差异，更重要的是质的不同。B一连环素／T细胞 cellfactor 因子4(T 4，TCF-4)信号通路，是细胞生长、发育的关键性信号系 统，且多与内胚源性器官相关。在大多数的结肠癌和一些胃癌、肝癌中该通 路已被证实具有重要作用。B．连环素和TCF．4是该信号通路的两个重要信 号分子。B一连环素作为多功能蛋白，一方面同E-钙粘连素结合形成细胞连 接；另一方面，人核与TCF-4结合形成复合物，激活wnt信号通路下游靶 cancer， 基因转录。尽管B一连环素在非小细胞肺癌(non一8nlal]一cell lung 解。而TCF-4作为具有高度保守的高迁移率组蛋白盒(highmobilitygroup box，HMG BOX)的TCF家族的主要成员，在肺癌中的研究仅限于几个细胞 系。本实验首先通过免疫荧光、免疫组化、RT—PCR技术分别观察B-连环素 素／TCF-4信号通路与NSCLC病理过程的关系。 方 法 l实验材料 60例NSCLC组织，8例癌旁正常组织取自中国医科大学第一附属医院 胸外科2001年9月一2003年3月手术标本，均经病理诊断证实。一部分组 织经石蜡包埋，用于免疫组织化学研究；一部分组织经组织包埋剂包埋，用 于免疫荧光观察；另一部分组织经液氮冷冻后置于-70。C保存．用于RT，PCR 和Western blotting分析。 2实验方法 2．1免疫荧光：冰冻切片固定后，依次滴加p-连环素鼠抗人单克隆抗 体，荧光标记二抗，核复染，应用激光共聚焦显微镜观察肺癌组织内B。连环 素的蛋白分布。 2．2 条带的整合光密度值，检测B一连环素mRNA的相对含量。 2．3免疫组织化学：石蜡切片，用兔抗人TCF-4多克隆体、过氧化物酶 标记的链酶卵白素(SP)染色试剂盒检测TCF-4的蛋白分布和表达，结合显 微图像分析软件分析TCF-4的蛋白表达强度。 2．4 带的整合光密度值，检测TCF-4mRNA的相对含量。 2．5蛋白提取：应用超速离心将组织的细胞核、细胞浆的蛋白分离。 2．6免疫沉淀和Western B一连环素／TCF4复合物沉淀，复合物经聚丙稀酰胺电泳分离，最后经化学 发光试剂检测。 3结果判定及数据处理 3．1B·连环素的免疫荧光观察：以癌旁正常支气管上皮细胞膜的染色 强度为标准，将肿瘤组织染色情况分两类，一类为同一视野内肿瘤细胞染色 强度与正常支气管上皮细胞膜的染色强度相同的细胞数大于或等于50％， 另一类为小于50％。如果细胞核的轮廓或位置能从蛋白质阳性染色中分 辨出来，既判定细胞核表达阳性。 数的t检验。B一连环素的mRNA表达在p一连环素细胞膜高、低表达组间以 及在B一连环素细胞核表达有、无组间的样本均数进行t检验。 3．3TCF-4的免疫组织化学观察：根据切片细胞核或细胞浆的阳性细 胞数将染色模式分为4类：仅细胞核染色或细胞核染色的细胞数多于细胞 浆染色的细胞数，仅细胞浆染色或细胞浆染色的细胞数多于细胞核染色的 细胞数，细胞核、细胞浆均染色且染色的细胞数相近，细胞核、细胞浆无染 色。各染色模式间进行X2检验。代表细胞染色强度的积分光密度值，进行 样本均数的t检验。 ·2- mRNA的相对含量进行样本均数的t 3．4TCF4的mRNA表达：TCFM 检验。 3．5B．连t；F素／TCF4复合体的表达：免疫沉淀后蛋白质经电泳、转膜、 化学发光检测，胶片在92KD处有清晰条带，即判定复合体表达。