弓形虫速殖子体培养及银杏酸等对其增殖抑制作用的研究.pdf

摘 要 摘 要 研究目的： 刚地弓形虫病是一种在世界范围内广泛流行的人兽共患寄生虫病。 不仅对孕妇和新生儿构成了极大的威胁，近年来又成为AIDS等免疫功能 缺陷患者死亡的重要因素之一。现有的抗弓形虫药物几乎都存在远期治 疗效果差、易复发、价格昂贵且对免疫功能缺陷患者基本无治疗效果等 诸多不足，开展新型抗弓形虫药物的研究具有重要的现实意义。药物研 究依赖于高效稳定的弓形虫体内和体外培养模型，建立弓形虫培养模型 不仅可用于筛选新型抗弓形虫药物，还可用于抗弓形虫药物的作用机理 研究。 研究方法： 弓形虫速殖子腹腔感染昆明小鼠，建立速殖子体内培养模型，并探 讨了体内模型长期传代保种的方法。将弓形虫速殖子接种HFF细胞和 HeLa细胞，建立速殖子体外培养模型，吉姆萨染色镜下观察速殖子在细 胞中增殖的速率。建立速殖子HeLa细胞连续传代保种技术，探讨温度和 时间对速殖子产率和活率的影响。 探讨胰酶消化法、3 离心法和Percoll离心法纯化体内培养和体外培养模型获得速殖子的效 率。 以速殖子HFF细胞培养模型为基础，MTT法测定银杏酸、阿奇霉素 和大蒜素对HFF细胞的安全浓度，MTT法和核素掺入法分别测定银杏酸、 江苏大学博士论文：弓形虫速殖子体外培养及银杏酸等对其增殖抑制作用的研究 阿奇霉素和大蒜素对虫体增殖的抑制效果，并探讨药物的作用机理。吉 姆萨染色镜下连续观察银杏酸和阿奇霉素对速殖子的抑制效果。 细胞的安全浓度，观察不同浓度银杏酸对第一代速殖子和第二代速殖子 的抑制作用。Real．TimePCR技术分别测定银杏酸、阿奇霉素、克林霉素 和环丙沙星对第一代和第二代速殖子顶质体增殖抑制效果。 研究结果： 速殖子可在昆明小鼠体内传代保种，每2--3天传代1次。小鼠腹水 细胞内增殖。HFF细胞接种速殖子后72h即可被完全破坏，而HeLa细 胞则需要96h才被完全破坏，速殖子在HFF细胞内增殖速度明显快于 HeLa细胞。速殖子在HeLa细胞内可进行连续传代保种，目前已传至十 代以上。虫体在细胞内增殖速度和传代时间稳定、形态良好，未见毒力 明显减弱。在速殖子体外培养研究中发现，将培养于HeLa细胞中速殖子 首先置于37℃培养72h，再置于25C培养120h后，速殖子的产率达40 倍以上，且活率大于90％，残留很少量Hela细胞。 5种纯化方法中，以胰酶消化法的速殖子回收率最高，体内和体外培 体内和体外培养速殖子的回收率分别为0．36％和0．19％。3lxrn滤膜过滤 法和CF一11纤维素过滤法都可以完全清除虫体悬液中的白细胞，但对红 细胞的清除效果不明显。CF．11纤维素过滤法的回收率高于3 lan滤膜； 但3岬滤膜过滤法方便快捷。Ficoll离心法对红细胞清除效果较好，但 Ⅱ 摘 要 虫体回收率很低；而Percoll离心法虫体回收率较高，但对红细胞的清除 效果不理想。 MTT法和核素掺入法测定银杏酸、阿奇霉素和大蒜素的体外抗弓形 虫效果显示，银杏酸的抗虫效果与阿奇霉素相近，银杏酸对HFF细胞毒 性略低于阿奇霉素。通过吉姆萨染色观察到银杏酸和阿奇霉素均可在8h 内完全清除HFF细胞内培养的速殖子。核素掺入法结果表明，银杏酸和 阿奇霉素的抗虫机理在于抑制速殖子DNA和蛋白质的合成。 以Real．TimePCR研究银杏酸、阿奇霉素、克林霉素和环丙沙星对第 一代和第二代速殖子顶质体增殖的特异性抑制作用。结果表明：经阿奇 霉素、克林霉素和环丙沙星处理后的第二代速殖子项质体数量较同代的 未用药处理组明显降低，但药物处理后第一代虫体与未处理虫体顶质体 数量无显著性差异。经银杏酸处理后的第一代与第二代速殖子顶质体与 同代的用药处理组之间无明显差异，银杏酸无特异性抑制顶质增殖能力； 但经银杏酸处理后的两代速殖子核基因组拷贝数较相应的未处理组显著 降低。 结论： 弓形虫速殖子体内培养模型操作简单，虫体增殖率高，但代价高昂， 液氮保种可作为动物保种的补充。体外培养模型也能获得增殖的速殖子， 还可用于速殖子连续