海洋生物技术第七章基因工程的下游技术精要.ppt

内容提要 第一节 基因工程菌生长代谢的特点 第二节 基因工程菌的不稳定性 第三节 基 因 工 程 菌 中 试 第四节 重 组 工 程 菌 的 培 养 第五节 高密度发酵 第六节 基因工程药物的分离纯化 第七节 变性蛋白的复性 第八节 基因工程产品的质量控制 第九节　基因工程产品制造实例 第一节 基因工程菌生长代谢的特点 菌体的生长常用比生长速率（每小时单位质量的菌体所增加的菌体量）表示。 工程菌培养可通过选用不同的碳源控制补料和稀释速率等方法控制菌体的生长。 控制菌体的生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物积累、提高外源蛋白产率有重要意义。 大肠杆菌的蛋白/菌体量的比值是基本恒定的，因而菌体的生长速度反映了蛋白质的合成速度。 培养条件的改变，会改变菌体的能量代谢和小分子前体的供应，影响生物大分子的合成和菌体的生长。 一、菌体的生长与能量的关系 菌体生长由呼吸控制，碳源决定菌体在该培养基的最大比生长速率。 菌体生长所需能量大于有氧代谢所能提供的能量时，菌体产生的代谢副产物乙酸抑制菌体的生长。 在高密度培养时，提高培养基pH可减弱乙酸的作用。 分批培养中选用不同的碳源、补料培养中控制补料速度、连续培养中控制稀释速率等，通过降低供能速度和前体供应速度，在一定范围能控制菌体生长，实现高密度培养和提高产物的表达水平。 实质： 控制菌体的糖酵解速度，使之低于三羧酸循环和呼吸链的最大代谢能力，从而避免乙酰辅酶A的积累和乙酸的产生，以降低供能速度或前体供应速度来降低蛋白合成和菌体生长速度。 大肠杆菌中克隆携带氧能力的VHB蛋白的基因可提高菌体生长速率。 采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为宿主细胞，阻止乙酸产生，可提高产量。 二、菌体生长与前体供应的关系 在基础培养基中加入氨基酸（小分子前体）能使菌体比生长率提高，蛋白合成增加。 基因工程菌质粒的表达需与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构，导致工程菌生长速率降低。 质粒存在对菌体代谢的影响：中等拷贝质粒（56拷贝）的工程菌中与前体合成有关的酶增加，这些酶的基因大多受终产物的反馈调节。 高拷贝质粒的工程菌（240拷贝）中，生长速率和菌体总蛋白合成均减少。这与工程菌大量前体被利用引起前体不足，从而产生“严紧反应”有关。 “严紧反应”是当氨酰tRNA不足时,核糖体在密码子上停留,并合成被称为魔点的ppGpp的结果。 ppGpp是一个重要的调控分子。它通过影响RNA链的延深过程减少转录。 (1)ppGpp—四磷酸鸟苷（在G的5和3位点各附着两个磷酸） (2) pppGpp—五磷酸鸟苷（鸟苷5一三磷酸-3二磷酸）。 它的浓度增加会导致 在合成mRNA和rRNA时 RNA聚合酶在模板上 的移动产生停顿，RNA 链延长速度减慢，使游 离的RNA聚合酶浓度降 低，严紧控制的启动子如rrnA等的转录减少。 也可能ppGpp是通过干扰RNA聚合酶与PL启动子专一识别反应。 一、质粒的不稳定性 基因工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象，又分为分裂不稳定和结构不稳定。分裂不稳定是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。结构不稳定是指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。 质粒不稳定产生的原因 分裂不稳定、结构不稳定二种类型 （1）含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率 （2）两种菌的比生长速率差异的大小 （质粒拷贝数低/高） 质粒稳定性的分析 将工程菌培养液样品适当稀释，在不含抗性标记的平板培养基培养10-12h，随机选100个菌落接种到含抗性标记的培养基培养10-12h，统计长出的菌落数，计算比值——ST（stability） 二、提高质粒稳定性的方法 （1）选择合适的宿主菌 宿主菌的比生长速率、基因重组系统的特性、染色体上是否有与质粒和外源基因同源序列等。 （2）选择合适的载体 低拷贝质粒工程菌——不含质粒子代频数大 高拷贝质粒工程菌——比生长速率低于不含质粒菌 调控比生长素率可改变质粒拷贝数 （3）两阶段培养法 ①使菌体生长至一定密度 ②诱导外源基因的表达 （4）在培养基加入选择性压力 （加入抗生素抑制质粒丢失菌的生长） （5）控制培养条件 （温度、pH、培养基组分、溶解氧浓度） （6）固定化 第三节 基 因 工 程 菌 中 试 中试应考虑的问题 适合商品化生产的工程菌 设计发酵反应器 选择反应过程 发酵培养基组分 维持生产工艺最佳化的方法 工艺监测、控制、自动化使用方法 生物催化剂的使用 产品分离、纯化方法 一、工程菌选择（条件） 能用一般基因重组技术获得 有高产潜力 能以工业原料（碳源）为培养基 生产工艺能用